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II型鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirμs2，CyHV-2）是引起养殖异育银鲫（Carassiμs aμratμs gibeLio）造血器官坏死症的致病病原。该病毒对鲫具有很高的致死率，近年来爆发的异育银鲫疱疹病毒性造血器官坏死病给中国异育银鲫的养殖业带来了很大的危害，所以为了控制CyHV-2的传播，快速诊断异育银鲫是否感染上CyHV-2显然是比较重要的一部分。在临床筛查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技术已经建立，但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。因为单克隆抗体技术拥有可以重复、抗体获得量大、特异性强等优点，可用于构建免疫性更强的免疫学诊断技术。本研究旨在构建一株能够稳定分泌针对CyHV-2上衣壳蛋白72的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，为建立快速准确的免疫学诊断技术提供实验材料。 本研究通过纯化CyHV-2病毒，并从纯化的CyHV-2基因组中扩增出ORF72基因，通过制备多克隆抗体和单克隆抗体从而建立免疫性更强的免疫学诊断技术。主要包括以下三个方面： （1）利用从江苏射阳取的组织样品进行检测鉴定，经检测鉴定确定为CyHV-2病毒后在实验室利用人工感染体系进一步对CyHV-2病毒进行扩增，在进行CyHV-2病毒纯化前，取感染CyHV-2病毒的病鱼的肾脏、肝脏及肾脏进行研磨，并进行初步离心处理，接着用超速离心沉淀病毒，并用蔗糖梯度的方法纯化病毒，再经过去蔗糖处理后获得纯度较高的CyHV-2病毒。经电镜观察可以观察到清晰可见的CyHV-2病毒，表明已成功获取到纯化后的CyHV-2病毒，此方法可以进一步鉴定异育银鲫是否感染CyHV-2病毒，并为制备多克隆抗体和单克隆抗体从而建立免疫性更强的免疫学诊断技术提供试验材料。 （2）本研究目的是利用CyHV-2编码的ORF72基因（GenBank登录号：AFJ20502.1）所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原，通过识别感染病毒的鱼体中的相应抗体，从而对样本进行临床免疫学检测。首先采用PCR方法从纯化的CyHV-2基因组中扩增ORF72基因，并把该基因克隆至原核表达载体 PGEX-4T-3，并转化到大肠杆菌中诱导表达，诱导表达的产物通过SDS-PAGE进行鉴定，对重组蛋白的表达进行纯化。用已纯化的72重组蛋白对小鼠进行免疫，制得72重组蛋白的抗体。Western Blot检测表明所制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白，也可以识别CyHV-2病毒粒子上的衣壳蛋白72。在上述基础上建立了基于Western Blot技术的CyHV-2抗体检测技术：用纯化的72重组蛋白作为检测抗原，鲫血清用作一抗，兔抗鲫IgM多克隆抗体作为二抗，酶标羊抗兔作为三抗鉴定鲫是否存在CyHV-2特异性抗体。在对急性感染期的临床样本检测中，本方法能在所有样本中检测出ORF72特异性抗体存在，表明72重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于确诊鲫是否感染CyHV-2。本部分建立的实验室免疫学检测方法为商品化免疫学检测技术的开发奠定了基础，对CyHV-2的检验检疫具有一定的临床应用价值。 （3）通过制备抗72重组蛋白的多克隆抗体试验结果表明72重组蛋白可以作为抗原免疫小鼠从而使小鼠产生抗72重组蛋白的抗体。通过将抗原按照常规免疫的方式免疫BABL/c小鼠，最后一次免疫以后的第三天取免疫后小鼠的脾脏与SP2/0细胞经PEG4000的作用后进行融合并产生融合后的细胞，即制备成杂交瘤细胞。经过多次亚克隆后获得一株能分泌出抗CyHV-2 rORF72的单克隆抗体，并将其命名为3D8。并通过注射具有分泌抗体能力的细胞进而产生腹水的方式制备大量3D8株单克隆抗体。异育银鲫肾脏及脾脏组织切片用单克隆抗体3D8进行检测后，建立通过异育银鲫血涂片法用单克隆抗体3D8检测异育银鲫是否感染CyHV-2病毒的免疫学检测方法。 本研究通过成功纯化CyHV-2病毒，从而获得较好的扩增CyHV-2病毒ORF72基因的试验材料。然后制备抗rORF72的多克隆抗体，结果说明rORF72能够成功地免疫小鼠并产生抗rORF72的多克隆抗体，同时表明72重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于确诊鲫是否感染CyHV-2。但为了制备特异性更好的抗体，本研究接着制备了单克隆抗体并建立应用血涂片法快速检测异育银鲫是否感染 CyHV-2的免疫学检测方法。