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系膜细胞(MC)及其基质改变是糖尿病肾小球损害的重要特征。高糖可刺激MC增殖、肥大,合成Ⅳ型胶原蛋白增加,并导致基质蛋白的降解减少。目前认为,糖尿病状态下持续、反复的系膜溶解、增生过程可能是糖尿病肾小球系膜病变的重要机制。研究发现,纤溶-抗纤溶系统活性的异常参与了糖尿病肾小球MC及系膜基质改变。高糖环境下,人MC表达组织型纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、uPA受体(uPAR)明显增加,这一现象在动物实验中也已得到证实。增加的纤溶酶与uPA、tPA可激活基质金属蛋白酶(MMPs),加速肾小球系膜基质的降解。但是与此同时,糖尿病MC中纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)表达也有明显增加。系膜PAI-1可与tPA、uPA结合而间接抑制MMPs活力,也可直接抑制MMPs活力。糖尿病状态下MC中纤溶-抗纤溶成分uPA、uPAR、PAI-1均有明显增加的矛盾现象,提示MC自身调节功能紊乱,使系膜中正常的纤溶、抗纤溶平衡被打破,表现为纤溶分子与抗纤溶分子的激活共存。但这一现象的分子机制及病理生理学意义目前尚未明确。本研究假设：糖尿病MC中uPA、uPAR的激活可能是MC对高糖环境的适应性反应,是对抗高糖所致MC增殖、系膜基质增加的重要机制,也是糖尿病状态下持续、反复的系膜溶解、增生现象的分子生物学基础。因此,本研究拟通过体外、体内糖尿病模型,探讨外源性uPA对系膜改变的影响及其分子机制,为临床使用药物干预糖尿病肾小球MC及系膜基质损害提供理论依据。第一部分uPA对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及表型转化的影响及其机制目的通过体外培养大鼠MC,观察uPA对高糖环境下MC增殖及表型转化的影响及其可能的信号转导机制。方法体外培养大鼠MC,分为4组：(1)对照组(含5 mM D-葡萄糖)；(2)高糖组(含30 mM D-葡萄糖)；(3)高糖+wortmannin组(含30mMD-葡萄糖+6h后加入100μM wortmannin);(4)高糖+uPA组(含30mMD-葡萄糖+6h后加入1×105 U/L uPA)。应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测各组MC增殖情况,流式细胞仪分析各组MC细胞周期改变,Western Blotting法检测各组MC表达CDK2与p27Kip1变化,并测定MC中信号蛋白Akt的活性。应用激光共聚焦显微镜检测各组MC中a-SMA表达方式及表达量变化。结果(1)高糖组MC培养24h后,MTT法显示细胞增殖程度较对照组均有明显增加(P<0.01),高糖+wortmannin组、高糖+uPA组细胞增殖明显低于高糖组(P<0.05)；流式细胞仪检测到Go/G1期细胞较对照组明显减少(P<0.01),G2/M+S期细胞较对照组明显增加(P<0.01),高糖+wortmannin组、高糖+uPA组Go/G1期细胞较高糖组明显增加(P<0.01),而G2/M+S期细胞较高糖组明显减少(P<0.01)。(2)高糖组MC培养3h后,信号分子Akt活性较对照组即有明显增加(P<0.05),而高糖+wortmannin组、高糖+uPA组Akt活性均较高糖组明显减低(P<0.01)。高糖组MC培养24 h后,p27Kip1蛋白表达较对照组明显减少(P<0.05)；高糖+wortmannin组、高糖+uPA组p27Kip1蛋白表达均较高糖组明显增加(P<0.01)；各组CDK2蛋白表达无明显变化(P>0.05)。(3)高糖组MC培养24 h后,胞浆中a-SMA表达明显增加(P<0.01),并在核周出现聚集。高糖+wortmannin组、高糖+uPA组a-SMA表达量均较高糖组明显减少(P<0.01),其分布方式与对照组无显著差异。结论uPA通过抑制Akt信号分子活性,上调p27Kip1表达,拮抗高糖致MC增殖与表型转化的作用··第二部分uPA对糖尿病肾小球系膜细胞PAI-1表达及基质金属蛋白酶-2、-9活性的影响及其机制目的通过糖尿病大鼠模型及体外大鼠MC培养,观察uPA对糖尿病肾小球MCPAI-1表达及基质金属蛋白酶-2、-9活性的影响,并探讨其可能的机制。方法制作STZ诱导的糖尿病大鼠模型共20只,随机分为糖尿病组、糖尿病+uPA组,另取10只未造模大鼠为对照组。成模后9w起,予糖尿病+uPA组大鼠尾静脉注射uPA(2500 U/kg),每日1次,连续4w。每日监测活化凝血时间,如大于正常3倍,则停用1d。4w末,留取24h尿标本,测24h尿蛋白量。处死动物,心脏取血测血糖、血肌酐。摘取双肾经处理后待作组织学染色、uPAR与PAI-1免疫组化检查。体外培养大鼠MC,分为3组：(1)对照组(含5 mM D-葡萄糖)；(2)高糖组(含30mMD-葡萄糖)；(3)高糖+uPA组(含30mMD-葡萄糖+6h后加入1×105 U/L uPA)。应用明胶酶谱分析MMP-2、MMP-9活性,分别行RT-PCR、Western-blot法检测uPAR、PAI-1 mRNA及蛋白表达。结果(1).糖尿病大鼠注射uPA后ACT均未超过正常3倍。4w末糖尿病组大鼠尿蛋白显著增加(P<0.05)；糖尿病+uPA组大鼠尿蛋白较糖尿病组明显减少(P<0.05)；三组大鼠血清肌酐无明显差异(P>0.05)。(2)组织学染色显示,糖尿病组大鼠肾小球体积明显增大,系膜基质显著增加；糖尿病+uPA组大鼠与糖尿病组比较,肾小球体积、系膜基质异常均有改善。免疫组化染色显示,对照组大鼠系膜uPAR与PAI-1无明显表达,糖尿病组大鼠系膜uPAR、PAI-1表达明显增加(P<0.05),糖尿病+uPA组大鼠系膜uPAR表达较糖尿病组无明显改变(P>0.05),但PAI-1表达明显减少(P<0.05)。(3)明胶酶谱法显示,高糖组MMP-2、MMP-9活力较对照组明显减弱(P<0.05),高糖+uPA组MMP-2、MMP-9活力较高糖组明显增加(P<0.05); RT-PCR与Western Blot分析显示,高糖组MC的uPAR、PAI-1 mRNA与蛋白均较对照组明显增加(P<0.05)；高糖+uPA组MC的uPAR mRNA与蛋白、PAI-1 mRNA与高糖组比较无明显差异(P>0.05),但PAI-1蛋白含量较高糖组明显减少(P<0.05)。结论uPA可通过增加MMP-2、MMP-9活力的途径减轻高糖环境或糖尿病所致的系膜基质增加；uPAR介导的PAI-1降解过程的加速可能是uPA改善糖尿病系膜基质病变的重要分子机制。