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一、背景与目的:胚胎着床是一个复杂的生物学过程,需要成熟的胚胎和接受态的子宫内膜同时建立。在胚胎植入过程中,胚泡表面的滋养层介导胚胎和子宫内膜之间的识别,促进胚胎的植入、胎盘发育以及维持成功的妊娠。在正常妊娠过程中,滋养层细胞能够降解细胞外基质、侵入母体子宫内膜及血管,建立母胎之间的连接。滋养层细胞增殖和侵袭能力的缺失可阻碍胚胎植入,导致流产,以及妊娠相关疾病,例如胎儿宫内生长受限(fetal intrauterine growth restriction,FIGR),先兆子痫(preeclampsia)等。蛋白质O-岩藻糖基转移酶1(protein O-fucosyltransferase 1,poFUT1)是催化蛋白质O-岩藻糖合成的关键酶。课题组前期研究表明:与正常早孕相比,流产患者滋养层细胞poFUT1的含量显著下降;poFUT1促进滋养层细胞的侵袭及增殖能力。但是对poFUT1在滋养层细胞参与胎盘血管重塑中的作用及机制未见报道。本文旨在探讨poFUT1对滋养层细胞在胎盘血管生成中的作用及其机制,这将有助于深入理解胚胎植入的机理,并为临床上以糖为靶点的流产等妊娠相关疾病的诊断和治疗提供新的理论依据。二、方法:1.免疫组织化学染色检测正常妊娠早期绒毛和流产患者绒毛中CK7、poFUT1和血管生成标志物CD34的表达;免疫组织化学染色检测健康孕妇和流产患者蜕膜组织中HLA-G、CD34的表达。2.运用Real-time PCR、western blot检测poFUT1 cDNA、poFUT1 siRNA的转染效率;transwell、F-actin检测滋养层细胞的迁移和骨架重排能力;明胶酶谱检测上清中MMPs的分泌;基质胶成管实验分析细胞成管能力;western blot检测血管生成相关蛋白的表达。3.O-Fucose试剂盒检测滋养细胞表面总O-岩藻糖的表达;蛋白质免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)检测尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)上O-岩藻糖含量;纤维蛋白酶谱法检测培养液中uPA的表达。4.利用脂质体瞬时转染poFUT1 cDNA、poFUT1 mutant、uPA cDNA、uPA mutant至滋养细胞(HTR-8/SVneo)内,western blot检测细胞周期蛋白的表达;transwell检测细胞的迁移能力;用小管形成实验分析细胞成管能力;用uPAR免疫共沉淀检测与uPAR结合的uPA;western blot检测滋养细胞中RhoA信号通路的激活。5.收集经过不同处理的滋养细胞培养液作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC),western blot检测细胞周期蛋白的表达;transwell、F-actin检测细胞迁移和骨架重排能力;小管形成实验分析两种细胞共成管能力;western blot检测HUVEC中RhoA信号通路的激活。6.鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)体内验证:收集人绒毛组织,经poFUT1 siRNA(50nM)处理后作用于CAM上,观察CAM上血管的变化。三、结果:1.收集正常早孕与流产患者的绒毛和蜕膜组织样品进行免疫化学染色,检测发现:与正常早孕相比,流产患者绒毛组织poFUT1表达显著降低,形成的螺旋动脉管腔小。流产患者蜕膜组织HLA-G的表达降低,螺旋动脉管腔直径明显小于正常早孕管腔直径。2.poFUT1促进滋养层细胞的血管形成。Transwell、F-actin结果均表明,与对照组相比,转染poFUT1 cDNA,滋养层细胞的迁移能力明显增强,而转染poFUT1 siRNA则抑制滋养层细胞迁移。明胶酶谱分析培养液中基质金属蛋白酶(MMP2、MMP9)的表达,结果显示,转染poFUT1 cDNA以后,MMP2及MMP9的分泌增加。成管实验结果表明,转染poFUT1 cDNA组,滋养细胞的成管能力显著增强,血管相关标志物CD31、CD34和血管生成相关蛋白(VE-cadherin、VEGFR2、uPA)的表达显著增加。3.poFUT1增加uPA上O-岩藻糖的生物合成。O-Fucose结果显示,转染poFUT1siRNA以后,滋养细胞总的O-岩藻糖表达降低,poFUT1 siRNA+poFUT1 cDNA组可以回调O-岩藻糖的表达。蛋白的免疫共沉淀结果表明,转染uPA cDNA组,uPA上O-岩藻糖表达增加,而转染uPA mutant组,滋养细胞的O-岩藻糖基化水平与未转染组相比,未见明显变化。纤溶酶谱结果显示,转染poFUT1 cDNA组,培养液中uPA分泌增加。4.poFUT1通过增加uPA的O-岩藻糖基化促进滋养层细胞的增殖、迁移和血管形成。细胞周期蛋白的western blot结果显示,转染poFUT1 cDNA和uPA cDNA可以促进滋养层细胞的增殖。Transwell、成管实验结果显示,转染poFUT1 cDNA、uPA cDNA组,滋养层细胞的迁移和成管能力明显增强。用uPA特异性受体uPAR进行IP实验,结果表明,转染poFUT1 cDNA、uPA cDNA组,与uPAR结合的uPA增多,转染poFUT1 mutant和uPA mutant,与uPAR结合的uPA与未转染组相比未见明显变化。RhoA信号通路的western blot结果显示,转染poFUT1 cDNA和uPA cDNA组,RhoA-GTP、p-LIMK1和p-cofilin表达增强。而加RhoA信号通路抑制剂(C3 transferase),可以抑制上述蛋白的磷酸化水平。5.收集经过不同处理的滋养层细胞的培养液作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。Western blot结果显示,poFUT1 cDNA转染组滋养层细胞的分泌液可以促进内皮细胞的增殖。Transwell、F-actin结果显示,poFUT1 cDNA转染组滋养层细胞的分泌液可以促进内皮细胞的迁移,促进内皮细胞骨架的重排。成管实验结果表明,内皮细胞经poFUT1 cDNA转染组滋养细胞的分泌液处理以后,与滋养层细胞的共成管能力显著增强。Western blot检测RhoA信号通路结果显示,poFUT1 cDNA转染组滋养层细胞的分泌液促进RhoA-GTP、p-LIMK1和p-cofilin的表达。6.鸡胚绒毛尿囊膜体内实验证明:与PBS处理组相比,加绒毛组织处理组尿囊膜上毛细血管分布和充血状显著增强。而绒毛组织经poFUT1 siRNA处理后,与未经处理绒毛组相比,血管分支减少,充血状态降低。四、结论:1.poFUT1促进滋养层细胞的增殖、迁移,同时可以促进滋养细胞的血管生成。2.poFUT1通过上调uPA上的O-岩藻糖的合成,增加与其受体uPAR的相互作用,促进血管生成。3.poFUT1通过上调uPA上的O-岩藻糖基化而激活RhoA信号通路,进一步提高血管生成能力。