背景与目的：恶性肿瘤已成为威胁人类健康的第一杀手，且在全球范围内的发病率及死亡率呈逐年上升趋势。化疗仍然是目前恶性肿瘤治疗的主要手段之一。由于肿瘤组织具有异质性，不同类型肿瘤对抗癌药物的敏感性不同，即使是同一类型的肿瘤，由于患者遗传背景不同，对抗癌药物的敏感性也不尽相同。而临床上化疗方案的选择大多凭医师经验，同一化疗方案固定不变的应用于许多患者，忽视个体差异，使总体疗效不佳。　　近年来，随着恶性肿瘤药物敏感性试验（简称“药敏试验”）的迅速发展，以药敏试验结果为基础的个体化治疗对临床抗癌药物的筛选，联合化疗方案的制定和预测患者生存期发挥着重要作用。尤其是对于那些癌症晚期不能手术且合并大量胸腹水的患者，可以无菌穿刺获得胸腹水标本，分离提取其中的肿瘤细胞进行药敏试验，筛选出高度敏感抗癌药物，对癌症患者进行个体化治疗，可以显著提高化疗效果，减少耐药和不良反应的发生。[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐]（MTS）比色法由于操作简便，无需特殊设备，可简单迅速分析大量样品，成本低廉，因此广泛应用于临床肿瘤药敏试验。但其也存在一定的局限性，由于MTS比色法的原理是：在偶联剂吩嗪硫酸二甲酯（PMS）存在的条件下，MTS可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成水溶性的深棕色的甲瓒产物，其不能排除肿瘤组织中正常细胞对其药敏试验结果造成的影响，因此，建立能区分开抗癌药物对正常细胞与恶性肿瘤细胞的杀伤作用，特异性强的肿瘤药敏试验方法成为肿瘤治疗领域的热点。由于端粒酶活性几乎在所有的恶性肿瘤细胞高表达，而在正常体细胞中极少表达，因此端粒酶活性药敏试验法可以克服上述MTS比色法的不足，其原理是：检测抗癌药物作用前后恶性肿瘤细胞的端粒酶活性，从而反映抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤程度。由于国内外相关报道较少，其在临床肿瘤药敏试验中的应用还有待进一步探索验证。　　本研究第一部分将采用密度梯度离心法从55例患者无菌穿刺的癌性胸腹水中提取肿瘤细胞，再采用MTS比色法检测其对9种常用抗癌药物的体外敏感性，为癌症晚期合并胸腹水患者选择最佳化疗方案及实现个体化治疗提供依据；第二部分将建立一种新型的端粒酶活性药敏试验方法，即实时荧光定量端粒重复序列扩增（RQ-TRAP）法，并探索其应用于体外药敏试验中的可行性及与MTS比色法在预测肿瘤细胞对抗癌药物敏感性之间的差异，从而为其作为肿瘤药敏试验的新方法应用于临床肿瘤治疗提供理论依据。　　第一部分 MTS比色法检测癌性胸腹水对9种常用抗癌药物的体外敏感性研究　　方法：无菌穿刺收集2011年10月至2012年10月在广州医学院附属肿瘤医院住院的55例肿瘤患者新鲜癌性胸腹水标本。采用密度梯度离心法分离提取41例患者癌性胸水和14例患者癌性腹水中的肿瘤细胞，并采用HE染色进行鉴别。再采用新型四氮唑比色（MTS）法检测癌性胸水对多西他赛（DOC）、氟脲嘧啶（5-FU）、博来霉素（BLM）、顺铂（CDDP）、长春瑞滨（VNR）、奈达铂（NDP）、吉西他滨（GEM）、培美曲塞（MTA）和癌性腹水对DOC、5-FU、BLM、CDDP、VNR、NDP、GEM、奥沙利铂（L-OHP）的敏感性，以及8种抗癌药物对41例癌性胸水中35例非小细胞肺癌（NSCLC）胸水细胞的抑制作用；并观察在各抗癌药物浓度为1倍的血浆峰值浓度（1×PPC）时，接受抗癌药物治疗的癌症患者的临床疗效与采用MTS比色法进行体外药敏试验所得结果之间的相关性。　　结果：癌性胸腹水中的肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性与药物的浓度呈正相关，在药物浓度为1×PPC时，癌性胸水对抗癌药物的敏感性依次为：NDP>CDDP>VNR>GEM>5-FU>MTA>DOC>BLM，癌性腹水对抗癌药物的敏感性依次为：NDP>L-OHP>CDDP>VNR=GEM>5-FU>BLM>DOC；在药物浓度为5×PPC时，癌性胸水对抗癌药物的敏感性依次为：NDP=CDDP>GEM>VNR>5-FU>DOC>MTA>BLM，癌性腹水对抗癌药物的敏感性依次为：NDP=CDDP>L-OHP>VNR>GEM>5-FU>BLM>DOC。　　8种抗癌药物对NSCLC胸水细胞的抑制作用具有显著性差异（P<0.001）。在浓度为1×PPC时，IR比较具有显著性差异的有NDP、CDDP>GEM>VNR>5-FU、DOC、BLM、MTA，其他各药物之间相比无显著性差异；在浓度为5×PPC时，IR比较具有显著性差异的有NDP、CDDP>GEM>VNR、5-FU>BLM>DOC、MTA，其他各药之间无显著性差异。　　在抗癌药物浓度为1×PPC时，接受化疗的癌症患者采用MTS比色法进行体外药敏试验所得结果与其临床疗效具有良好的相关性（P<0.05），MTS比色法评估体内化疗效果的总预测准确率可达75.7％，敏感性为87.5%，特异性为53.8%，阳性预测值为77.8%，阴性预测值为70.0%。　　结论：MTS比色法作为一种简便、快速、安全的体外药敏试验常用方法，可为癌症晚期合并胸腹水患者的选择合适的化疗方案、实现个体化治疗提供依据；对于癌症晚期合并胸腹水患者的化疗方案可首选铂类化合物，其次为GEM和VNR；给药剂量可以根据药敏试验结果进行调整，从而提高治疗效果，减少毒副作用。　　第二部分实时荧光定量端粒酶活性药敏试验方法的建立　　方法：选择人宫颈癌细胞株（Hela）和正常人胚肺成纤维细胞株（MRC-5）作为试验模型。取对数生长期的Hela及MRC-5细胞，采用CHAPS细胞裂解液将其裂解，提取端粒酶RNA，将Hela细胞端粒酶提取液以10倍等比稀释，采用实时荧光定量端粒重复序列扩增（RQ-TRAP）法检测Hela及MRC-5细胞的端粒酶活性，并建立Hela细胞端粒酶活性随其数量变化的标准曲线。　　以100个Hela细胞所提取的端粒酶RNA为基准，与不同数量的MRC-5细胞所提取的端粒酶RNA以1:1，1:2，1:5，1:10，1:50比例混合，采用RQ-TRAP法检测混合后的端粒酶活性，并与100个Hela细胞端粒酶活性进行比较，观察混入不同数量的MRC-5细胞对Hela细胞端粒酶活性的影响。　　取处于对数生长期的Hela细胞，待其与顺铂（CDDP）、多西他赛（DOC）作用24 h后，采用MTS比色法测定CDDP、DOC半数抑制浓度（IC50）。另取对数生长期的Hela及 MRC-5细胞，将其以细胞数量1:1进行混合设为 Hela细胞与MRC-5混合细胞组，另设Hela细胞组及MRC-5细胞组。抗癌药物CDDP与DOC的浓度分别为其24 h对Hela细胞的IC50。待各细胞组与CDDP、DOC作用24 h后，分别采用MTS比色法及RQ-TRAP法检测各细胞组对CDDP、DOC的敏感性，观察以上两种方法在预测各细胞组对抗癌药物敏感性中的差异。　　结果：Hela细胞的端粒酶活性是MRC-5细胞的851.06倍，可见MRC-5细胞端粒酶活性表达显著低于Hela细胞。100个Hela细胞所提取RNA分别与100、200、500、1000、5000个MRC-5细胞所提取RNA混合后的端粒酶活性与100个Hela细胞组的端粒酶活性比较结果在统计学上无显著性差异（P>0.05），不同数量的MRC-5细胞混入对Hela细胞端粒酶活性无显著性影响。　　CDDP、DOC对Hela细胞24 h的IC50值分别为53.384μg/ml和150.859μg/ml。MRC-5细胞组端粒酶活性表达量很低，几乎检测不到，表明端粒酶活性在正常细胞中低表达，而在恶性肿瘤细胞中高表达。对于Hela细胞组，采用RQ-TRAP法所测得的CDDP、DOC抑制率均比采用MTS比色法高，其中CDDP组的比较结果在统计学上有显著性差异（P<0.05）；对于Hela与MRC-5混合细胞组，采用RQ-TRAP法所测得的CDDP、DOC抑制率均比采用MTS比色法高，且CDDP、DOC组的比较结果在统计学上均具有显著性差异（P<0.001）。采用MTS比色法所测得的CDDP、DOC对混合细胞组的抑制率显著低于Hela细胞组的抑制率（P<0.001）。而采用RQ-TRAP法所测得的CDDP、DOC对混合细胞组的抑制率与其对Hela细胞组的抑制率在统计学上均无显著性差异（P>0.05）。　　结论：本研究建立了实时荧光定量端粒重复序列扩增（RQ-TRAP）法。采用该法检测抗癌药物作用前后肿瘤细胞端粒酶活性变化，可以反映肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。在体外药敏试验中，RQ-TRAP法灵敏度及特异性均显著高于MTS比色法，主要是由于MTS比色法不能区分开抗癌药物对恶性肿瘤细胞与正常细胞杀伤作用，而RQ-TRAP法只检测存在于恶性肿瘤细胞中的端粒酶活性，因此可以排除混入的成纤维细胞对药敏试验结果的影响。RQ-TRAP法作为药敏试验的新方法，可快速筛选出高度敏感的抗癌药物，提高临床治疗效果，降低毒副作用提供依据。