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目的:宫颈癌（Cervical cancer,CC）是世界范围内最常见的妇科肿瘤之一,高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus,HR-HPV）持续感染已被证实是其组织发生和进展的重要致病因素。近年来,随着HPV预防疫苗的广泛应用,CC的一级预防取得了一定的成效,其发病率和死亡率在许多发达国家得到了有效控制。然而,较高的HPV感染率和较低的CC发病率,这不仅使CC筛查和初级预防成为卫生经济学的沉重经济负担,也提示个体遗传和免疫状态差异等重要因素是CC进展的重要因素。因此,探索CC发生的分子机制,寻找潜在的治疗靶点是十分必要的。研究证实,人类基因组只有不到2%的核苷酸序列编码蛋白质,而其余的大多数基因被转录成非编码RNA。近年来,随着RNA测序技术和生物信息学的发展,环状RNA（Circular RNA,circRNA）成为继微小RNA（microRNA,miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）之后的又一疾病研究的热点。与传统的线性结构的miRNA和lncRNA不同,circRNA是一个共价键闭合的连续环。circRNA由于缺少3’、5’端和多聚A尾,可以避免外切酶和RNase R的降解作用。与线性RNA相比,circRNA保守稳定,具有细胞特异性、组织特异性和阶段特异性。目前,对circRNA生物学功能的研究还处于探索阶段。研究者已经证实circRNA作为竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNAs,ceRNAs）,即miRNA海绵,调控靶基因的表达。它们也可以作为转录调节剂或蛋白结合RNA,甚至可以在特定情况下直接翻译成蛋白质。许多潜在的circRNA分子标记物及其通路作为miRNA海绵已经在许多肿瘤中被发现,包括食管鳞癌、胃癌、胰腺导管腺癌、肝癌、结肠直肠癌、早期肺腺癌、胶质瘤和卵巢癌。然而,circRNA的表达谱及circRNA在宫颈癌发生中的作用仍不清楚。课题组前期工作明确了circRNA在宫颈癌中的表达谱,并证实了circRNA circTPCN在宫颈癌组织中高表达。本项目在前期工作的基础上,研究circTPCN对宫颈癌细胞系Hela细胞生物学行为的影响及其作用机制。研究方法:利用生物信息学检索方法预测circTPCN的干扰序列,化学合成sicircTPCN（1）、sicircTPCN（2）、无关序列sinc以及带有FAM荧光的无关序列sincFAM。利用转染试剂将上述序列瞬时转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。转染后,荧光性显微镜下观察转染sincFAM干扰序列的转染效率。转染48小时后,TRIzol法提取总RNA,检测RNA浓度及纯度后,逆转录为cDNA。逆转录PCR条件为:退火:25℃,5min;延伸:42℃,60min;70℃,15min;4℃保存。用circTPCN的特异引物及SYBR Green I荧光染料进行定量PCR检测,所用内参为18S。用miR-634、miR-195-5p、miR-455-3p的特异引物及SYBR Green I荧光染料进行定量PCR检测,所用内参为U6。荧光定量PCR反应条件为:95℃5 min;95℃15s;60℃60 s,共45个循环。CircRNA相对定量采用2-ΔΔCt法。2-ΔΔCt=2-（ΔCt siRNA-ΔCt sinc）,ΔCt siRNA=siRNA组Ct值的均值-对应内参18S或U6的Ct值的均值,ΔCt sinc=sinc组Ct值的均值-对应内参18S或U6的Ct值的均值,并将sinc组的相对表达量定为1,计算环状RNA的表达差异;转染后24小时,收取细胞,用细胞计数板计数转染干扰序列后的细胞数,进行增殖能力检测实验Hela细胞的增殖情况;转染后24小时,向转染体系中加入MTS试剂,孵育后利用酶标仪检测Hela细胞的增殖能力变化;转染后48小时,收集细胞,用Annexin V/FITC和PI试剂对各组细胞进行染色,孵育后,用流式细胞仪检测各组Hela细胞的凋亡情况。转染24小时后,进行细胞划痕实验。对孔板内转染后Hela细胞进行多条划痕并去除上清,用PBS清洗三遍,加入无血清培养基培养,在不同时间点对划痕变化进行观察;转染24小时后,收集细胞接种至Transwell小室内,上室为无血清培养体系,下室为高血清培养体系,培养24小时后,镜下计数各组穿膜细胞数,检测细胞的侵袭能力变化。结果:瞬时转染转染效率为27.5pmol组:87.5%;55pmol组:91.3%;110pmol组:93.5%。干扰序列物质的量确定为12孔板中55pmol/孔。MTS检测结果与细胞计数结果显示sicircTPCN（1）组Hela细胞的生长能力低于sinc对照组,差异有统计学意义。干扰序列sicircTPCN（1）转染Hela细胞后,circTPCN表达量为sinc组的25±1.5%,差异有统计学意义;sicircTPCN（1）转染组细胞凋亡率为44.35±2.3%,sinc对照组细胞凋亡率为16.35±0.92%,空白对照组细胞凋亡率3.2±0.56%,差异有统计学意义;sicircTPCN（1）转染组与sinc转染组相比,划痕间距缩小不明显;sicircTPCN（1）转染组Hela细胞穿膜数为48.67±5.51个/视野,显著低于sinc组（90±10）个和空白对照组（94.33±6.11）个。使用Arraystar软件预测了circRNA-miRNA的潜在相互作用,并预测miR-634/miR-455-3p/mir-195-5p可能是circTPCN的靶点。sicircTPCN（1）组Hela细胞miR-634表达增加,相对表达量可达对照组的45倍。转染sicircTPCN（1）组miR-455-3p和miR-195-5P的表达较对照组有明显增加,但增加幅度不大,其相对表达量分别为对照组2.8倍和5.5倍。TargetScan结合生物信息学分析和信息检索,发现mTOR可能是miR-634的下游靶点。Real time PCR结果表明,sicircTPCN（1）组mTOR（74.8±7.6%）表达较对照组有明显降低,提示抑制circTPCN能下调mTOR的表达,mTOR可能是circTPCN的下游靶基因。结论:化学合成的circTPCN干扰序列能显著降低细胞中circTPCN的表达。CircTPCN表达下调可显著抑制宫颈癌细胞系Hela细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。SicircTPCN（1）抑制circTPCN可显著上调miR-634的表达。CircTPCN抑制miR-634表达,显著抑制mTOR的表达。CircTPCN/miR-634/mTOR轴可调控宫颈癌Hela细胞的生物学行为,可能成为有效的宫颈癌治疗靶标。