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脯氨酰内肽酶(EC3.4.21.26,prolyl endopeptidase,简称PEP),是一种新型丝氨酸蛋白酶S28家族水解酶,特点是能够特异性水解多肽羧基末端的脯氨酸残基的肽键。脯氨酰内肽酶虽然广泛应用于生物医药、多肽、食品、酿造行业等,但是微生物来源少且多数产酶微生物的不安全性、酶活力低下、稳定性差等问题限制了其应用。目前多数研究主要集中在哺乳动物及细菌来源的脯氨酰内肽酶,食品级曲霉脯氨酰内肽酶相关研究较少,而食品级产酶菌在食品加工行业具有重大的应用价值。因此,本论文围绕着食品级脯氨酰内肽酶进行以下内容的研究。(1)本研究首先利用Fast Garnet GBC显色平板筛选、酶活测定、分子生物学以及微生物形态鉴定等方法获得产脯氨酰内肽酶活力较高的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)和米曲霉菌株(Aspergillus oryzae),分别命名为PEP2和PEP101,摇瓶发酵酶活分别为95U·L-1和81 U·L-1。纯化后发现分子量均在60 k Da附近;最适p H均为4.0,在酸性p H条件下活性保持较好,而其它来源的已知脯氨酰内肽酶均在中偏碱性环境稳定;最适温度在30-40℃范围内,55℃以下稳定性较好,且PEP2对温度比较敏感,稳定性较PEP101略差;Cu2+、Al 3+、Zn2+和Mn2+等金属离子对两种脯氨酰内肽酶(PEP2和PEP101)酶活力具有较大的负面影响;动力学研究PEP2和PEP101对Ala-Ala-Pro-p NA亲和性最高(Km均为0.18 m M),对Z-Gly-Pro-p NA催化效率最高(kcat/Km分别为996.2 m M-1S-1和924.3 m M-1S-1);底物特异性研究表明PEP2和PEP101对一肽和二肽均无水解能力,但可以切割三肽和四肽,也可以切割完整酪蛋白,推测它们对酪蛋白苦味去除均具有明显效果。(2)采用RT-PCR的方法,扩增A.niger脯氨酰内肽酶结构基因序列(1,578 bp,endoprotease EPR),构建基因工程菌株GS115/p PIC9K-end protease-EPR,诱导表达酶活为500 U·L-1,分子量约为60 k Da。性质表明重组酶最适温度为35℃,在55℃以下,温度稳定性较好;最适p H为4.0-5.0,在p H 3.0-7.0范围内较稳定;Ca2+对重组酶的活力具有促进作用,Cu2+、Al 3+、Zn2+和Mn2+强烈抑制重组酶活力,Mg2+和Fe2+部分抑制重组酶活力;光谱法研究表明重组酶蛋白在不同条件下二级结构及蛋白质构象的变化与酶活力的改变一致;动力学研究发现重组酶对Ala-Ala-Pro-p NA亲和性(Km为0.24 m M)和催化效率(kcat/Km分别为731.7 m M-1S-1)均最高;底物特异性研究发现重组酶对一肽和二肽没有水解能力,可以切割三肽和四肽,作用位点为Pro-X-X或Ala-X-X。(3)结合前期研究工作发现,相比其它来源的已知脯氨酰内肽酶,米曲霉脯氨酰内肽酶具有酸性条件下稳定,温度稳定性较好等性质,并且关于其编码基因仍未见有任何报道,所以具有一定的应用优势和较高的研究价值。通过同源序列分析,设计简并引物和特异引物,首次扩增获得编码A.oryzae脯氨酰内肽酶的结构基因(1,743 bp,AO-PEP)。通过同源建模,发现与其序列相似性最高的是人源脯氨酸羧肽酶(18.2%,PRCP,PDBID:3n2z B)。AO-PEP催化三联体是Ser-206、Asp-479和His-528,保守序列G204SSYSG209,具有α/β水解酶的典型结构。构建表达AO-PEP毕赤酵母基因工程菌GS115/p PIC9K-AO-PEP,重组酶酶活为310 U·L-1,分子量约为64 k Da。重组酶纯化后,酶学性质研究表明最适温度为40℃,在60℃以下,温度稳定性较好;最适p H为5.0,在p H 3.5-7.5的范围内较稳定;Ca2+对重组酶的活力均表现出较好的促进作用,Cu2+、Al 3+、Zn2+和Mn2+强烈抑制脯氨酰内肽酶的活力,Mg2+和Fe2+也对重组酶的酶活也产生部分抑制,K+和Na+对该酶的活力基本没有影响;动力学研究发现与野生型(PEP101)相比差异不大,AO-PEP对Ala-Ala-Pro-p NA亲和性最高(Km为0.28 m M)和催化效率(kcat/Km分别为497.8 m M-1S-1)均最高;底物特异性研究表明重组酶对一肽和二肽均无水解能力,但可以切割三肽和四肽。(4)为了提高AO-PEP的催化活性,本论文采用定点突变方法对A.oryzae脯氨酰内肽酶酶活性中心组氨酸排列方式的位点(Cys529和Gln533)及底物结合口袋附近loop环的氨基酸Thr位点(T391和T537)进行突变,构建了10个突变体(T391A、T391C、T537A、T537C、C529H、C529H/Q533R、T537A/T391A、T537A/T391C、T537A/C529H和T537A/C529H/Q533R),诱导表达发现突变体作用p H稳定性和温度稳定性范围均增大,除T391A和T391C外,突变体的酶活也具有较大提高。动力学研究表明突变体T391C、C529H/Q533R、T537A/T391A、T537A/T391C和T537A/C529H/Q533R对底物Z-Gly-Pro-p NA较AO-PEP具有更好的亲和性,且突变体对底物的催化效率都有了部分提高;AO-PEP m RNA的转录水平研究结果表明除T391A和T391C外,其余突变体m RNA转录水平都比AO-PEP的高,最高值达到42倍;该研究表明酶活性位点催化组氨酸排列方式和活性中心对面不规则区loop环的柔软性可能对米曲霉脯氨酰内肽酶催化活性起着关键作用。(5)为提高重组脯氨酰内肽酶的保存稳定性,充分挖掘食品级脯氨酰内肽酶在改善啤酒非生物稳定性特性的潜能,该论文通过添加一系列小分子化合物对酶保存稳定性及热失活动力学进行测定后,发现甘油在重组酶的保存稳定性起着最关键的作用,同时开发获得对酶保存稳定性具有良好作用的复配酶制剂;应用研究中两种重组脯氨酰内肽酶能够显著提高啤酒非生物稳定性,表明重组脯氨酰内肽酶在酿造行业具有重要的应用价值。