猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度传染性疫病,是危害养猪业的主要疫病之一。PRRSV至少可编码产生13个非结构蛋白,其中NSP1、NSP2、NSP4、NSP11能够抑制Ⅰ型干扰素的表达。PRRSV NSP4位于ppla蛋白中,共编码204个氨基酸,分子量约为21kDa,具有3C样丝氨酸蛋白酶活性(3C-like serine proteinase,3CLSP),是PRRSV增殖过程中重要的蛋白酶,但有关PRRSV NSP4抑制Ⅰ型干扰素的机制目前尚未可知。本研究分别从IFN-β转录启动通路及NSP4与宿主细胞蛋白互作角度分析探讨NSP4抑制IFN-β表达的分子机制；并应用双荧光素报告系统、激光共聚焦技术及定点突变技术比较分析不同致病性PRRSV毒株NSP4蛋白抑制IFN-β转录差异的分子基础；同时,利用蛋白质组学技术分析NSP4蛋白表达对MARC-145细胞蛋白表达谱的影响,为PRRSV与宿主细胞互作研究提供数据信息,也为PRRSV分子致病机制的深入解析奠定基础。应用双荧光素酶报告系统分析不同致病性PRRSV毒株NSP4蛋白对IFN-β、IRF3和NF-κB等转录的影响。结果显示,低致病性毒株HB-1/3.9的NSP4对IFN-β的转录及相应的IRF3和NF-κB启动转录的抑制能力均弱于高致病性毒株JXwn06NSP4,统计学分析差异显著。对GenBank收录的45株PRRSV NSP4蛋白序列比对后发现,高、低致病性毒株的NSP4蛋白在其第76和155位氨基酸位点处存在差异(V76A/P, K155A/T)。遂利用定点突变技术,突变NSP4的差异位点,经荧光素酶报告质粒、NSP4表达质粒及内参质粒共转染MARC-145细胞,分析点突变后NSP4蛋白抑制IFN-β转录能力的差异。结果显示,位于第二个铰链区(Aa154-156)和核定位信号区域(Aa145-168)的第155位氨基酸位点T→K的突变能够显著降低宿主细胞内IFN-β的转录,是不同致病性PRRSV毒株NSP4抑制Ⅰ型干扰素转录差异的关键位点。运用双荧光素酶报告系统进一步证实,NSP4对IFN-P转录的抑制作用主要是通过其对IRF3和NF-κB通路活化的抑制而实现的,其中对NF-κB通路活化的抑制作用更为明显。激光共聚焦和Western Blotting结果显示,NSP4蛋白对NF-κB p65蛋白的核定位和磷酸化过程无影响,提示NSP4对NF-κB通路的细胞质阶段无影响。利用定点突变技术结合激光共聚焦、双荧光素酶报告系统分析NSP4的核定位性与其IFN-β转录抑制能力的相关性,结果显示缺失核定位信号区的NSP4在丧失核定位性的同时也丧失了其对IFN-β转录的抑制活性；添加核定位信号后,NSP4蛋白细胞核分布比例上升,同时抑制IFN-β转录的能力增强。研究结果提示,NSP4主要通过抑制NF-κB的活化抑制IFN-β的转录,且抑制效率与该蛋白在细胞核中的分布率呈正相关。在建立稳定表达高致病性PRRSV毒株JXwn06及低致病性PRRSV毒株HB-1/3.9NSP4蛋白的MARC-145细胞基础上,应用AP-MS(亲和纯化和质谱鉴定联用)技术从蛋白质相互作用的角度分析了NSP4抑制IFN-P转录的分子基础。共筛选到9个可以与NSP4发生相互作用的宿主蛋白,其中2个蛋白可能与调节干扰素表达相关。通过RNA干扰和双荧光素酶报告技术对其中NONO蛋白的作用机制进行分析,结果显示,干扰NONO蛋白的表达能够’下调polyIC激活的IFN-β转录水平,但对NSP4抑制IFN-β转录的过程无影响。表明NSP4并非通过与NONO蛋白相互作用而抑制IFN-β的转录。运用2D DiGE(荧光差异双向电泳)技术分析了表达不同致病性PRRSV NSP4蛋白的MARC-145细胞蛋白表达谱的差异,蛋白质组学分析结果显示,与对照组MARC-145细胞相比,表达HB-1/3.9NSP4的MARC-145细胞有33个蛋白点呈现差异表达；表达JXwn06NSP4的MARC-145细胞有27个蛋白点呈现差异表达,两者间共有6个蛋白点存在差异表达。研究结果表明,病毒NSP4蛋白的表达对宿主细胞蛋白质表达谱具有影响,且不同致病性毒株NSP4蛋白对宿主细胞蛋白质表达谱的影响存在差异,这些差异表达的蛋白与NSP4抑制干扰素转录机制的相关性还有待于进一步研究。综上所述,PRRSV NSP4主要通过抑制NF-κB通路活化’下调IFN-β转录,且对IFN-β转录的抑制效率与蛋白的核内分布率呈正相关；第155位氨基酸位点是导致不同致病性PRRSV毒株NSP4对IFN-β转录抑制效率差异的关键位点。