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研究背景/目的:目前在构建骨组织工程中血管形成的作用越来越受到广泛关注,但在构建骨组织工程中,血管形成和成骨分化之间的分子机制目前尚未阐明。人羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSC)是一种来源于人废弃胎盘表层的多潜能干细胞具有向成骨细胞,成软骨细胞和成脂细胞等多系分化的能力,hAMSCs也具有良好的血管生成能力;Schnurri-3(Shn3)也称为人类免疫缺陷病毒增强结合蛋白-3(human immunodeficiency virus type I enhancer binding protein 3,HIVEP3)属于BMP/TGF-?的同源物家族。由于Shn3在成骨细胞中的缺失导致Runx2蛋白水平升高进而增强骨形成;骨形态发生蛋白9(Bone morphogenetic protein 9)具有显著上调间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)中的各种成骨分化过程中成骨相关因子的表达也能够刺激血管生成相关因子表达。然而,目前Shn3是否能够调节以及如何调节BMP9诱导的hAMSCs在体内外成骨分化和血管形成尚不清楚。基于此,在本课题研究中探讨Shn3是否参与调节BMP9在体内和体外诱导的hAMSCs向成骨分化和血管形成作用的影响及其信号通路和分子机制。方法:(1)胰酶/胶原酶联合消化方法分离并培养hAMSCs,倒置相差显微镜观察其形态改变;使用第3代hAMSCs,通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞表面分子标志物的表达;免疫荧光染色鉴定hAMSCs中波形蛋白和CK-19的表达,检测对第3代hAMSCs向成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化潜能。(2)通过构建重组腺病毒(adenovirus,Ad)外源性过表达BMP9(Ad-BMP9)、Shn3(Ad-Shn3)和沉默Shn3腺病毒(Ad-Sim-Shn3)以及红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)(Ad-RFP)转染第3代hAMSCs后,观察转染效率,并使用qRT-PCR检测Shn3基因在细胞中的表达情况;使用碱性磷酸酶染色和生化定量检测第3、5和7天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的早期成骨分化效应;使用茜素红S染色和骨矿化定量观察第14和21天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的晚期骨矿化的作用,并使用qRT-PCR检测第7天时过表达Shn3对BMP9诱导的成骨相关基因Runx2(Runt related transcription factor 2)、骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein,BSP)、I型胶原(Collagen type I,COL-I)、和成骨相关转录因子OSX(Osterix)的mRNA表达水平。(3)通过使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染技术,设BMP9组,Sim-Shn3组,BMP9+Sim-Shn3组和BMP9+Shn3组,分别转染第3代hAMSCs在24h后,将细胞打入裸鼠皮下形成裸鼠体内异位骨化的模型,在4周左右时收取异位骨块样本,并通过Micro-CT(μ-CT)对骨块扫描并行分析,对骨块行固定、包埋和切片染色,使用Masson’s Trichrome三色染色、H&E染色(hematoxylin and eosinstaining)对切片行骨小梁数量和分布进行分析,番红O固绿染色(Safranin O-fast green staining)染色观察异位成骨内软骨形成情况。使用免疫组织化学染色对各实验组异位骨块切片行染色观察,主要观察异位骨块内成骨相关指标包括OCN和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)以及血管形成相关分子如血管生成素-1(Angiopoietin 1,ANGPT1)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在异位骨块中的数量和分布情况。(4)使用细胞免疫组化技术观察过表达或沉默Shn3腺病毒转染细胞后,对BMP9诱导的第3代hAMSCs血管分化指标VEGF的表达及分布。使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,与人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)在Transwell小室内共培养,其中腺病毒转染的hAMSCs在上层,HUVECs细胞在下层,使用基质胶(Matrigel)铺于板底,观察HUVECs细胞的小管形成能力,简介检测过表达或沉默Shn3对BMP9诱导的hAMSCs血管形成能力。(5)使用电纺聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA)共聚物支架材料,将过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)对支架材料的机构和搭载细胞后的细胞长入情况进行观察和分析。通过使用上述支架材料搭载转染腺病毒后的各实验组细胞,在培养48h后,将PLGA-细胞复合物移植入小鼠背部皮下组织内,在5周后,收集小鼠背部皮下移植物样本,并对样本行大体观察移植物在体内的血管长入情况,之后对移植物样本行免疫组织荧光染色,观察其血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)在移植物内的表达和分布。(6)使用蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,其成骨分化相关指标OCN、OPN和Runx2的蛋白表达水平;通过使用Western blot技术,检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对BMP/Smads经典的信号(Smad-1/5/8)进行蛋白印迹检测其表达;通过染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对成骨相关转录因子Runx2和VEGF的直接作用关系。结果:(1)使用胰酶和II型胶原酶联合消化方法可以一次性获得大量形态均一的hAMSCs;通过细胞传代之后到第3代hAMSCs时,hAMSCs可稳定表达波形蛋白,而低表达CK-19;流式细胞检测第3代hAMSCs细胞表面分子标志物符合MSCs鉴定的表型。第3代hAMSCs具有向成骨、成软骨和成脂细胞分化的潜能。(2)重组腺病毒外源性过表达BMP9(Ad-BMP9)、Shn3(Ad-Shn3)和沉默Shn3腺病毒(Ad-Sim-Shn3)以及红色荧光蛋白(Ad-RFP)成功转染第3代hAMSCs后,且qRT-PCR结果显示Shn3在72h左右达到峰值。ALP染色和碱性磷酸酶活性结果显示,在第3、5和7天时,外源性过表达Shn3减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应,而沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应;茜素红S染色和骨矿化定量结果提示在第14和21天时,外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的hAMSCs晚期骨矿化和钙结节的形成;qRT-PCR结果显示在第7天时,外源性过表达Shn3下调了BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关因子包括Runx2、BSP、COL-I和OSX的mRNA表达。(3)在上述Shn3抑制BMP9诱导的hAMSCs体外成骨分化的基础上,进一步研究了Shn3对BMP9诱导的裸鼠皮下异位骨形成的成骨分化的影响。使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染BMP9诱导的第3代hAMSCs细胞后制造的裸鼠异位成骨模型中,大体观察结果和micro-CT结果显示,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组异位成骨的骨体积减小。与其他组相比,BMP9+Sim-Shn3组具有较强的异位成骨能力。Micro-CT的分析结果显示外源性Shn3表达增加了BMP9在hAMSCs中诱导异位骨块的平均骨密度,相反,外源性过表达Shn3降低了BMP9诱导的hAMSCs异位骨形成的平均骨密度。骨组织形态学定量分析显示骨体积/总体积(Bone volume/total volume,BV/TV)、骨小梁数量(Trabecular number,Tb.N),骨小梁厚度(Trabecular thickness,Tb.Th)和骨密度(Bone mineral density,BMD)与BMP9组相比,在BMP9+Sim-Shn3组有显著增加,相反,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组的上述参数有不同程度的下降,但骨小梁分离度在各组中无明显差异。组织化学染色结果显示与BMP9组相比,Sim-Shn3可增加了BMP9诱导的异位成骨中小梁骨数量和骨基质的形成。而外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的骨基质形成,同时免疫组化染色结果显示沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的异位骨化中成骨相关因子OCN和OPN以及血管形成相关因子ANGPT1和VEGF的表达,但外源性过表达Shn3基因抑制了此种效应。(4)细胞免疫组化染色结果显示,在第7天是,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs血管分化相关指标VEGF的表达;免疫荧光染色结果显示HUVECs细胞表达内皮粘蛋白(Endomucin,EMCN)、CD31、VEGF和vWF分子的表达;在与HUVECs细胞使用Transwell共培养诱导小管形成实验结果同样显示,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs间接小管形成的能力。(5)在使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜结果显示,细胞在PLGA电纺支架中生长情况良好,多数细胞能够贴壁;PLGA-细胞复合物移植入小鼠皮下的血管形成实验样本大体观察结果显示,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的皮下血管长入,且样本的免疫荧光染色结果提示,较其他各组中,沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的血管形成相关分子vWF的表达。(6)Western blot结果显示,在第7天是,较其他各组,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关指标包括OCN、OPN和Runx2的蛋白水平表达;外源性过表达BMP9增强了Smad1/5/8的磷酸化水平,同时Sim-Shn3显著增强了BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化表达。ChIP分析结果表明,转录因子Runx2能够在BMP9诱导的hAMSC中与VEGF启动子区域相结合。且免疫沉淀和免疫印迹结果表明外源性沉默Shn3的表达能够增强BMP9诱导的细胞中转录因子Runx2对其下游分子VEGF启动子的活性,证明了转录因子Runx2与VEGF分子之间的直接作用关系。结论:(1)人羊膜间充质干细胞具有MSCs的基本表型,具有向多系分化的能力包括成骨、成软骨及成脂细胞的潜能。(2)外源性沉默Shn3基因表达能够增强BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化,而外源性过表达Shn3基因表达则减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化。在外源性沉默Shn3表达后,能够加强BMP9诱导的hAMSCs在体外的血管形成。(3)通过沉默Shn3基因表达可以在体内外促进BMP9诱导的早期和晚期成骨分化以及血管形成的这一过程中,这可能是通过增强BMP/Smads信号来介导,并且Shn3在参与调节BMP9诱导的hAMSCs成骨分化和血管形成的双向效应中,Shn3通过调节关键成骨转录因子Runx2,激活其下游分子VEGF以促进BMP9诱导的hAMSCs的成骨和血管生成方面,Shn3发挥了重要的作用。