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葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)是由葡萄球菌产生的、已超过20种基因型报道的、氨基酸序列和结构相似,具有潜在超抗原活性的一组食源性致病毒素。目前对新发现肠毒素结构、功能活性的认识和不同型肠毒素的检测鉴别尚缺乏有效手段。制备型特异性单抗对认识不同型肠毒素的结构和功能、不同毒素的检测鉴别、分析肠毒素基因簇的表达调控机制等具有重要意义。本研究通过构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)和O(SEO)的原核表达载体,应用纯化的重组葡萄球菌肠毒素制备了两种肠毒素单克隆抗体,并对单抗特性做了研究。应用克隆的肠毒素基因sea、selo构建pET28α原核表达载体,转化重组菌BL21(DE3)表达,经镍鳌合层析纯化获得可溶性重组蛋白SEA-His、SEO-His。应用已构建的pEGX-6P-SEA和pEGX-6P-SEO表达载体转化宿主菌BL21,经诱导表达、亲和层析纯化获得SEA-GST、SEO-GST重组蛋白,以此蛋白为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,3次免疫后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备杂交瘤细胞。以SEA-His、SEO-His为包被蛋白建立间接ELISA方法筛选阳性克隆,阳性率分别为8.5%(34/400)、5.3%(24/450)。有限稀释法对SEA肠毒素阳性杂交瘤细胞4A2,SEO肠毒素阳性杂交瘤细胞5C12、8C7进一步亚克隆,获得稳定分泌抗重组肠毒素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A型:4A2-C5、4A2-B10;O型:5C12-C3、5C12-B4、8C7-G2、8C7-H8。对亚克隆获得的杂交瘤细胞株分泌的单抗特性进行了研究。经间接ELISA检测,4A2-C5、5C12-C3、8C7-G2杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:1600、1:1600、1:6400,腹水效价分别达1:6.4×10~3、1:5.12×10~4、1:1.024×10~5;3株单克隆抗体4A2-C5、8C7-G2、5C12-C3亲和常数分别为3.35×10~6、1.89×10~6、1.45×10~6;亚类鉴定结果显示,4A2-C5、5C12-C3为IgG2b亚类;8C7-G2为IgM亚类。竞争ELISA对单抗识别抗原位点的分析结果表明,5C12-C3和8C7-G2分别识别SEO蛋白的不同抗原表位;Western blotting表明获得的3株单克隆抗体均能识别相应重组蛋白的B细胞线性表位;应用SEB和SEC1肠毒素阳性血清的阻断ELISA结果表明,SEA、SEO、SEB和SEC1肠毒素间存在交叉抗原。通过单抗特异性鉴定,结合肠毒素成熟肽氨基酸比对、表位预测、易接近性预测、二级结构预测分析,推断获得的3株单抗为葡萄球菌肠毒素群特异性抗体。这为葡萄球菌肠毒素功能特性的分析、检测奠定了基础。