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目的:前列腺癌是危害全世界男性健康的首要恶性肿瘤之一,在欧美等西方国家前列腺癌的年发病率居男性肿瘤的第1位,死亡率居第2位,在我国,前列腺癌发病率已跃居为男性恶性肿瘤的第3位。前列腺癌常为隐匿发病,确诊时多已经发生浸润或转移,其高死亡率及高术后复发率主要与其易转移有关,死于前列腺癌的患者中85%~100%合并远处转移。前列腺癌细胞最远转移部位是骨,晚期前列腺癌骨转移十分常见。大多数发生远处转移的前列腺癌会发展为雄激素非依赖性前列腺癌,因此常规的内分泌治疗效果不理想。目前针对发生远处转移的前列腺癌尚无有效的治疗方法,预后极差,生存期一般短于2年。因此,深入探讨前列腺癌发生机制,找寻治疗前列腺癌关键靶点及切实有效的治疗药物迫在眉睫。泛素连接酶E3具有调控基因转录、稳定质膜蛋白、降解错误蛋白与抑癌因子等多种作用,参与恶性肿瘤发生发展过程。泛素连接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1均包括一个C2区域,2-4个WW区域和一个HECT区域,故具有相似的功能与共同的特性。大量的研究指出泛素连接酶E3家族成员与前列腺癌的发生、迁移、浸润和转移密切相关,如研究发现WWP1在多种侵袭性前列腺癌细胞株中高表达,而且下调WWP1表达水平可导致癌细胞生长抑制。硼替佐米是一种新型泛素-蛋白酶体通路抑制剂,目前主要作为抗多发性骨髓瘤药物应用于临床,虽有研究发现硼替佐米可抑制前列腺癌发生及浸润,且可抑制肿瘤远处转移,但具体量-效关系、时间-效果关系及其作用机制尚不明确,已有资料提示硼替佐米对泛素连接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1表达水平亦有调节作用。本研究旨在分析探讨硼替佐米通过调控泛素连接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1的表达水平,从而对前列腺癌细胞增殖发挥抑制作用,为Smurf1、Smurf2及WWP1作为前列腺癌治疗新靶点及硼替佐米应用于前列腺癌治疗提供依据。本研究应用一系列实验方法,通过检测药物处理对雄激素非依赖性人前列腺癌PC3细胞株的细胞增殖率、Smurf1、Smurf2及WWP1 m RNA及蛋白表达水平的影响,进而探索硼替佐米对前列腺癌细胞增殖的作用模式及机制。方法:1细胞培养在严格无菌的环境下,将人前列腺癌PC3细胞接种于含DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基的细胞培养瓶中培养,隔日换液,待细胞汇合度达90~95%时,以胰蛋白酶进行消化,并进行传代培养,待传至3-5代后取细胞进行实验。2分组2.1空白对照组(不进行任何药物处理);2.2硼替佐米处理组(硼替佐米浓度梯度设置为:0.5、5、15、25μmol/L,作用时间:24 h、48 h,72 h)3细胞增殖率测定采用Brdu ELISA法测定各组细胞增殖情况及其活性变化。4细胞泛素连接酶Smurf1、Smurf2及WWP1 m RNA水平测定硼替佐米处理PC3细胞72小时后,提取细胞内RNA。应用实时定量聚合酶链式反应(Real time-PCR,Real Time-Polymerase Chain Reaction)对各组细胞泛素连接酶WWP1、Smurf1及Smurf2 m RNA水平进行检测。5细胞泛素连接酶Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平测定硼替佐米处理PC3细胞72小时后,提取蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度。应用Western blotting方法对各组细胞泛素连接酶Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平进行检测。6统计学方法本研究所得数据均录入SPSS 18.0软件进行分析处理,计量资料均以“均数±标准误”表示,应用SNK-t检验法进行两组比较,单因素方差分析AVON进行多组比较,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1 Brdu ELISA结果显示:1.1于药物处理后24 h、48 h及72 h三个时间点,相较于对照组,硼替佐米处理组PC3细胞增殖率均显著降低(P<0.05),且PC3细胞增殖率与硼替佐米使用剂量负相关,即硼替佐米浓度越高,对PC3细胞增值率抑制作用越强,PC3细胞增值率数值越低,呈现剂量依赖性,且在25μmol/L的浓度下抑制作用最为显著;1.2在药物浓度分别为5、15及25μmol/L的硼替佐米处理组中,PC3细胞增值率与处理时间长短负相关,即硼替佐米处理时间越长,对PC3细胞增值率抑制作用越强,PC3细胞增值率数值越低,呈现时间依赖性。2 Real time-PCR结果显示:经药物处理72 h后,相较于对照组,硼替佐米处理组PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 m RNA水平显著降低(P<0.05),且在一定范围内Smurf1、Smurf2及WWP1 m RNA水平与硼替佐米使用剂量负相关,即硼替佐米浓度越高,PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 m RNA转录水平越低,呈现剂量依赖性,且在25μmol/L的浓度下效果最为显著。3 Western blotting结果显示:经药物处理72 h后,相较于对照组,硼替佐米处理组PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),且在一定范围内Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平与硼替佐米使用剂量负相关,即硼替佐米浓度越高,PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平越低,呈现剂量依赖性,且在25μmol/L的浓度下效果最为显著。结论:1硼替佐米对雄激素非依赖性人前列腺癌PC3细胞增殖率的抑制作用在一定范围内随着药物浓度、作用时间的增加而增加,并呈剂量-时间依赖性。2在处理PC3细胞72 h后,硼替佐米可显著降低PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 m RNA水平(P<0.05),且该作用呈现剂量依赖性。3在处理PC3细胞72 h后,硼替佐米可显著降低PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平(P<0.05),且该作用呈现剂量依赖性。