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研究背景与目的食管癌（esophageal carcinoma,EC）是全世界最为常见的消化道恶性肿瘤之一,在全球范围内的发病率一直居高不下。我国也是食管癌高发的国家之一,发病率位列第六位,癌症死亡率位列第四位。食管癌按照其病理分型分为食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma,EAC）两种亚型,而ESCC是亚洲地区较为常见的病理类型,其中,我国食管癌有超过90%的病例为ESCC。食管癌因为其较强的侵袭性和致命性,以及对放化疗治疗的抵抗性,目前缺少高效的治疗药物,所以它仍然是重大的全球性挑战。近年来,免疫治疗和靶向治疗的使用极大地拓宽了癌症治疗的道路,并且开始应用于食管癌患者的临床治疗当中,但仍然有很多患者疗效不佳。因此,食管癌的预后标志物以及其发生发展、转移侵袭的具体分子机制仍然需要继续探索。肿瘤组织中浸润着许多免疫细胞,这些免疫细胞连同成纤维细胞和血管内皮细胞共同构成肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）。许多研究表明,肿瘤微环境中浸润的巨噬细胞具有促瘤的功能并与肿瘤的发生、发展密切相关,所以它也被称为肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）。肿瘤微环境中TAMs主要的作用包含促进细胞基质的重塑、促进血管的生成、以及抑制适应性免疫过程,再进一步发挥促进肿瘤侵袭和转移的作用,这离不开TAMs在微环境中以发挥M2型巨噬细胞的促瘤功能为主的原因。TAMs与肿瘤细胞的生长分化、转移侵袭成正相关,与患者的预后成负相关等结论在肺癌、肾癌、子宫内膜癌、胃癌、乳腺癌和口腔鳞状细胞癌等多种肿瘤中都已得到证实。此外,TAMs还通过分泌促进炎症细胞因子或趋化因子如IL-12、IL-10、TGF-β、CCL22等抑制抗肿瘤免疫反应。趋化因子C-C基序配体3（CCL3）是一个小的诱导型细胞因子,其编码的蛋白质,被称为巨噬细胞炎症蛋白1-α（MIP-1α）,通过与受体CCR1、CCR5和CCR9结合,在炎症反应中发挥作用。目前,TAMs分泌的趋化因子CCL3在食管癌发生发展中的作用机制尚不清楚,深入研究肿瘤微环境中TAMs在肿瘤细胞中的生物学行为,可以为进一步揭示食管癌发生发展的潜在机制提供重要的线索。本研究通过对食管鳞状细胞癌细胞株与M2型肿瘤相关巨噬细胞的共培养,研究CCL3对肿瘤细胞生长及迁移等恶性行为方面影响的具体作用机制,旨在为食管鳞癌探索新的生物靶向治疗提供依据。研究方法1.利用人单核细胞白血病细胞系THP-1细胞加入佛波酯（PMA）、IL-4构建M2型肿瘤相关巨噬细胞系。2.流式细胞检测技术检测M2型肿瘤相关巨噬细胞表面标志物CD163、CD206的表达情况。3.人细胞因子抗体芯片ARY017（可检测31种细胞因子）检测食管鳞癌细胞株单独培养组（对照组）、食管鳞癌细胞株与M2巨噬细胞共培养组（实验组）的细胞因子差异表达情况。4.Transwell迁移实验比较对照组与实验组的迁移能力;比较对照组、加入CCL3组、加入CCL3和抑制剂MVC组的迁移能力变化。5.实时荧光定量PCR技术（RT-q PCR）检测对照组、加入CCL3组、加入CCL3和抑制剂MVC组中zeb-1、snail、vimentin、N-cadherin的m RNA水平表达情况。6.Western blotting检测对照组、加入CCL3组、加入CCL3和抑制剂MVC组中zeb-1、snail、vimentin、N-cadherin的蛋白质水平表达情况。结果1.流式细胞术检测结果显示,M2型肿瘤相关巨噬细胞分子标志物CD163、CD206表达水平均增高。2.人细胞因子抗体芯片ARY017结果显示,与对照组相比,实验组中表达水平增加的细胞因子有IL-8、CCL3、CCL22、CCL5和CXCL7。3.Transwell迁移实验结果表明,与对照组相比,实验组细胞迁移能力增强;与对照组相比,加入CCL3组的食管鳞癌细胞株（ECA109、TE-1）的迁移能力增强;与加入CCL3组相比,加入CCL3和抑制剂MVC组的细胞迁移能力减弱。4.RT-q PCR实验结果显示,与对照组相比,加入CCL3组的食管鳞癌细胞株（ECA109、TE-1）中N-cadherin、vimentin、snail、zeb-1的m RNA水平表达上调;与加入CCL3组相比,加入CCL3和抑制剂MVC组较的N-cadherin、vimentin、snail、zeb-1的m RNA水平表达则下调。差异具有统计学意义。5.Western blotting实验结果表明,与对照组相比,加入CCL3组的食管鳞癌细胞株（ECA109、TE-1）中N-cadherin、vimentin、snail、zeb-1的蛋白质水平表达上调;与加入CCL3组相比,加入CCL3和抑制剂MVC组的N-cadherin、vimentin、snail、zeb-1的蛋白质水平表达则下调。差异具有统计学意义。结论1.M2型肿瘤相关巨噬细胞可以促进食管鳞癌细胞的迁移运动。2.M2型肿瘤相关巨噬细胞通过分泌趋化因子CCL3提高食管鳞癌细胞的迁移能力。3.CCL3提高食管鳞癌细胞迁移能力的部分机制可能通过调控细胞上皮-间充质转化（EMT）过程发挥作用。4.CCR5抑制剂（Maraviroc,MVC）可以介导EMT过程逆转CCL3的促细胞迁移能力。