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背景与目的: 呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)感染是婴幼儿毛细支气管炎的主要原因,是导致儿童住院治疗最常见的危险因素。据WHO估计,在2015年全球范围内,每年大概有3500万5岁以下的儿童感染RSV,并导致约320万人住院治疗,约6万人住院死亡[1];相比2005年的数据统计,儿童住院死亡率有所下降,但发病率仍然居高不下。肿瘤患者以及造血干细胞移植受者感染RSV后,可有较高的患病率和死亡率[2];婴幼儿有过严重RSV下呼吸道感染,其成年后喘息性疾病发生率将比正常同龄人升高。目前RSV引起的下呼吸感染致病机制不甚明了,临床尚无安全有效的疫苗和抗病毒药物。 我们前期研究工作发现,RSV感染离体培养的Calu-3细胞后CFTR氯离子通道基因表达水平上调、功能活动增强。本研究利用在体实验模型进一步验证RSV感染支气管上皮细胞后,CFTR氯离子通道基因表达水平是否上调。我们的研究为揭示RSV感染与毛细支气管炎、哮喘相关性以及进一步理解CFTR在喘息性疾病发生发展中的作用提供实验依据。 实验方法: 1.Hep-2细胞的培养及RSV病毒的增殖 Hep-2 细胞来源于喉癌的上皮细胞株,购买于广州吉尼欧生物科技有限公司,培养液为DMEM培养基中加入10%热灭活的胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)及1%双抗(青霉素、链霉素),培养条件为37℃,5%CO2的培养箱,当细胞融合达到90%以上时,吸掉旧培养基,PBS洗涤2次,接种RSV A2亚型标准株(重庆医科大学附属儿童医院刘恩梅教授的惠赠),37℃,5%CO2 培养箱中吸附 2hrs,每 20min 摇晃一次,使病毒充分吸附均匀,吸附结束后吸弃病毒液,病毒在含2%FBS的DMEM培养基(病毒维持液)中,37℃,5%CO2条件下培养,逐日在倒置显微镜下观察,当细胞病变(Cytopathie Effect,CPE)达到75%~100%时刮取病毒培养液,4℃,12000离心10min收集上清并分装,-80℃储存备用。最后通过空斑实验检测病毒滴度。 2.建立RSV感染BALB/c小鼠支气管上皮细胞模型 实验组用RSV A2株滴鼻感染BALB/c小鼠,对照组用Hep-2细胞悬液滴鼻,在感染后的第 3、5 天,取小鼠肺组织分别进行肺组织病理切片、病毒分离,及琼脂糖凝胶电泳技术验证肺组织RSV G蛋白mRNA的存在。 3.qRT-PCR技术检验BALB/c小鼠感染RSV后第7、14天CFTR基因表达的改变 实验结果: 1.经空斑实验测定,本实验所纯化RSV A2病毒滴度为3.6 ×106 PFU/ml。 2.采用三种方法证明RSV成功感染小鼠呼吸系统。 (1)RSV感染BALB/c小鼠第3天后,取肺组织匀浆液接种于Hep-2细胞上可引起细胞发生合胞体病变。 (2)其次,提取感染3天后实验组及对照组病毒核酸,逆转录成cDNA,并通过琼脂糖凝胶电泳技术验证了病毒的存在。 (3)感染第5天后,经HE染色,在光学显微镜下,可见明显炎症细胞浸润、肺组织病理损伤。 3.模型建立成功后,取实验组与对照组小鼠的肺组织,随后提取总RNA,逆转录成cDNA,运用qRT-PCR法检测RSV感染BALB/c小鼠后CFTR mRNA的表达水平,结果mRNA表达 = 2(-△△CT)。于RSV感染BALB/c小鼠第7天时,实验组CFTR mRNA表达水平低于对照组(n=11,P<0.05);于感染第14天时,实验组CFTR mRNA表达水平高于对照组(n=11,P<0.05)。 实验结论: 当小鼠在感染RSV第7天后,我们检测到支气管上皮细胞CFTR氯离子通道基因表达水平下调,而随着感染时间的延长,在第14天时,支气管上皮细胞CFTR氯离子通道基因表达水平上调。