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神经干细胞是指具有分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并提供大量脑组织细胞的细胞。它主要存在于胚胎和成年中枢神经系统脑室周围的广泛区域，但最近的研究显示骨髓基质细胞在一定条件下能诱导分化成神经干细胞，从而为神经干细胞的应用提供了无限制的来源。骨髓基质细胞源性神经干细胞的开发和应用，既克服了从脑组织获取神经干细胞的危险性和局限性，也避免了胎儿组织移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题，其在治疗中枢神经系统损伤和神经退行性疾病领域将会有广阔的应用前景。癫痫为神经系统常见病之一，其患病率占人群的5‰左右，国内统计约占全部居民的7‰。癫痫为一非特异性慢性脑疾病，它是由先天的或后天的不同原因导致的慢性脑功能失调所引起的一种临床症候群，其特征是由于大脑某些神经元突然过度高频放电所引起的具有各种临床（或实验室）表现的反复发作。颞叶癫痫为局灶性癫痫的主要类型之一，常有较特殊的嗅觉异常，意识障碍和醉梦状表现。其常见的病理学改变是海马硬化，即海马结构的一些区域神经元丢失和胶质增生。尽管前颞叶切除或选择性海马杏仁核切除可使部分颞叶癫痫病人得以痊愈，但手术本身有一定的危险性，可能会引起偏瘫、偏盲、记忆损害等，且对双侧颞叶的致痫灶不宜作双侧切除。因此，通过神经干细胞移植进行海马功能的修复重建实验研究，可以从一个新的角度来探索治疗、改善颞叶癫痫发作频率和程度的途径，具有潜在的临床意义。第一部分大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经干细胞实验研究一、目的探讨大鼠骨髓基质细胞在体外培养并诱导分化为神经干细胞的可行性，并确立骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞的适当培养方法及条件，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。二、材料与方法以SD大鼠为实验对象，无菌穿刺大鼠股骨骨髓腔抽取骨髓，梯度密度离心获得有核细胞，粘附法提取骨髓基质细胞。向提取的骨髓基质细胞悬液加入神经干细胞培养液，调整细胞浓度到106个／ml后，接种于多孔培养板中，再分别加胎牛血清（1％终浓度）、LIF（10ng／ml）及bFGF（10ng／ml）。在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养骨髓基质细胞，48h后换液以去除非黏附细胞，以后每周换液2次。原代培养一周后进行细胞传代培养，传代培养的细胞加入胎牛血清以及RA（0.5ug／ml），以诱导骨髓基质细胞向神经干细胞分化。然后在CK2型倒置光学显微镜下追踪观察培养的活细胞生长情况并拍照。采用SABC法进行免疫细胞化学检测，将不同阶段培养细胞经4％多聚甲醛固定，0.01MPBS冲洗，一抗37℃，孵育60min，生物素化二抗室温孵育10min，最后在链霉亲和素-生物素-过氧化酶复合物室温孵育10min，经DAB显色5～15 min，并在OLYMPUS光学显微镜下观察拍照。三、结果贴壁细胞培养48h后有分裂增殖，然后逐渐形成岛屿状细胞克隆团，给予适当的分化条件10～20d后，这些细胞能分化成具有细长突起、多种形态的细胞。经免疫细胞化学鉴定发现早期的培养细胞在没有给予诱导分化时可阳性表达Nestin，表明其具有神经干细胞的特性；培养细胞经诱导后有NeuN、NSE和GFAP阳性表达的细胞出现，且随着诱导时间的延长阳性表达的细胞逐渐增强，提示有分化为神经元样或神经胶质细胞样细胞的趋向。四、结论SD大鼠骨髓基质细胞在合适的体外培养条件下能够转化为神经干细胞，并保持增殖分化的能力。骨髓基质细胞源性神经干细胞能分化成具有神经系细胞特征的细胞，且能阳性表达NeuN、NSE和GFAP。第二部分大鼠骨髓源性神经干细胞自体移植治疗颞叶癫痫实验研究一、目的探讨骨髓源性神经干细胞自体移植至KA大鼠海马后与宿主细胞的整合及其对损伤宿主的修复作用，从而为神经干细胞移植治疗颞叶癫痫提供理论依据。二、材料与方法首先分离大鼠骨髓基质细胞，并在特定的条件下培养使其诱导分化为神经干细胞，使用Feridex对干细胞进行标记。将60只雄性SD大鼠随机分为三组：对照组、移植组及未移植组，每组20只。然后建立大鼠颞叶癫痫模型，将Feridex标记的神经干细胞自体移植到癫痫模型鼠的右侧海马CA3区，对KA未移植和对照组大鼠在相同的靶点注入等量的生理盐水。观察移植后1周、2周、4周、8周和16周大鼠海马的脑电图、MRI和病理学改变情况。三、结果KA注射大鼠均出现典型癫痫发作症状，且经过一段静止时间后大鼠均再次出现反复的自发性癫痫发作，发作类似杏仁核点燃；与KA未移植组相比，移植组大鼠海马脑电图的波幅明显降低，至移植8周后最高降低达40％以上；MRI检查发现在神经干细胞移植后1周和2周时低信号改变区比较局限，但移植4周、8周和16周后低信号改变明显增大，且随着时间的推移低信号改变区逐渐增大；病理学检查显示，KA移植组的CA3区锥体细胞数与未移植组和对照组相比较有统计学差异（P＜0.01）；在移植组内，各时间段之间相比也有统计学差异（P＜0.01），至移植后8周时细胞数最大，此后又开始下降；在KA未移植组，随着时间的推移，CA3区锥体细胞计数则呈现明显下降趋势；KA移植组海马损伤侧的Timm染色与未移植组和对照组相比有统计学差异（P＜0.01）；在移植组内，各时间段相比也有统计学差异（P＜0.01），至移植后第8周时Timm染色记分最小，但此后又开始增加；电镜超微结构检查显示移植组海马CA3区锥体神经元核仁明显，胞质内可见较多的脂褐素，线粒体肿胀，突触小泡数量较少。而未移植组海马CA3区锥体神经元游离核蛋白体减少，突触膜融合，突触小泡明显增多。四、结论骨髓源性神经干细胞自体移植至KA大鼠海马后对癫痫鼠的癫痫发作有一定的抑制作用，且能与宿主细胞进行整合，并对宿主海马具有显著的修复作用，但其具体的作用机理尚待进一步研究。