论文部分内容阅读
第一部分 骨髓增生异常综合征移植患者的预后分析背景骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)是一组源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,以外周血细胞减少,骨髓无效造血及高风险向白血病转化为特征。随着对疾病发病机制认识的深入,去甲基化治疗已经成为中高危MDS的标准治疗方案。但去甲基化治疗并不能治愈MDS,异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是目前唯一可能治愈MDS的手段。对于将要进行移植的MDS患者,如何选择适当的移植前治疗方案,确定最佳的移植时机,减少移植相关并发症改善预后,仍面临挑战。方法本研究回顾性分析了 2007年12月至2019年9月在苏州大学附属第一医院接受异基因造血干细胞移植的415例MDS患者临床资料,评估了影响MDS移植预后的危险因素。结果1.415例接受异基因造血干细胞移植的MDS患者,中位年龄为40岁,男性261例,女性154例。371例患者(89%)采用清髓性预处理方案(myeloablative conditioning regimen,MAC regimen)。44 例(11%)采用减低剂量预处理方案(reduced intensive conditioningregimen,RIC regimen)。根据移植类型,131 例(32%)接受 HLA 相合的同胞供者移植,81例(20%)接受无关供者移植,203例(49%)接受单倍体移植。135例(33%)患者在移植后100天内发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD,中位发生时间为移植后+28天(范围:4-98天)。在移植后+30天、+60天和+90天,Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的累积发生率分别为19.6%、31.2%和32.9%。374例移植后存活100天以上患者中,142例(38.0%)发生cGVHD,中位发生时间为移植后5.4个月(范围:3.4-34.5个月),38例(10.2%)患者表现为广泛性cGVHD。截止末次随访(2021-06-30),153例(36.9%)死亡,其中NRM 115例(27.7%)。移植后第1、2、3年NRM累积发生率分别为21.7%、25.1%和26.5%。在415例患者中,42例(10.1%)发生移植后复发,移植后1、3、5年的累计复发率分别为11%、14%和16%。65例(15.7%)患者移植后出现EBV再激活,中位发生时间为移植后+55天(范围:4-714天)。MDS患者EBV病毒血症的累积发生率在移植后1年和2年,分别为14.5%和26.0%。116例(28%)患者出现血小板重建不良,其中原发性重建不良48例(12%),继发性重建不良68例(16%)。2.多因素分析表明,年龄≥40岁(P=0.005,HR=1.73)、移植后发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD(P<0.001,HR=1.98)、广泛性 cGVHD(P=0.007,HR=1.92)及血小板重建不良(HR 1.82,P=0.003)是影响OS的独立危险因素。移植前发生AML转化是影响MDS患者移植后RFS的最重要的危险因素(HR=5.94,P=0.001)。而采用MAC预处理(HR=0.32,P=0.004)和输注骨髓联合外周血来源的干细胞(HR=0.63,P=0.027)可改善患者移植后RFS。EBV再激活也被证实是RFS的独立危险因素之一(HR=3.18,P<0.001)。移植后发生EBV再激活的患者,其RFS明显缩短,较EBV未活化组相比(1年RFS为89%,3年RFS为88%),其1年和3年RFS分别为78%和69%(P=0.006)。3.拟进行清髓性预处理移植的MDS患者,确诊后采用非化疗的治疗方式,并且在6个月内进行造血干细胞移植是比较适当的移植前策略,有助于改善患者预后。结论1.评估影响MDS移植预后的危险因素,有助于临床医生更精准的风险评估和临床决策。2.采用适当的移植前治疗策略有助于延长生存,改善患者预后。第二部分 驱动基因突变对骨髓增生异常综合征移植预后的影响背景MDS是一组异质性极大的血液系统恶性肿瘤。IPSS和IPSS-R是目前应用最为广泛的两个预后风险评分系统,但仍有部分患者的预后与其风险评分不一致,可能与体细胞突变有关。高通量测序技术,尤其是全外显子测序(whole exome sequencing,WES)和二代测序(next generation sequencing,NGS)的发展,为我们明确MDS的发病及进展机制,进行更精准的预后风险评估及靶向药物开发提供了有价值的信息。方法采用高通量测序技术WES和NGS对MDS移植患者的骨髓基因突变状态进行检测。同时结合患者临床特征,评估基因突变,尤其是RAS通路突变对患者移植预后的影响。结果1.本研究对92例MDS移植患者的骨髓标本进行WES测序,检测到45个已知的驱动基因突变,55例(59.8%)患者至少检测到其中一种突变。突变频率大于3%的基因有16种。根据基因突变的类型,最常见的基因变异类型为转录因子相关的基因(BCOR、CEBPA、ETV6、GATA2、NPM1、PHF6、RUNX1、TP53、WT1),总计22例。此外,22例涉及RNA剪切相关基因(U2AF1,SF3B1)、12例为甲基化(IDH1、IDH2、TET2、DNMT3 A)相关基因,11 例涉及染色体修饰(ASXL1、SETBP1),8例涉及RAS通路相关基因,其中NRAS突变3例,KRAS突变1例,CBL突变2例,PTPN11 突变 2 例,KIT 突变 1 例,RIT1 突变 1 例。U2AF1、TET2 及 SETBP1突变与MDS患者移植后不良OS及RFS相关,RUNX1突变与患者不良RFS相关。RAS通路突变是MDS患者移植后OS及RFS的不良因素。2.结合患者临床预后信息,WES总计发现了 22种新的肿瘤驱动基因,与患者OS和RFS密切相关。22种新发现的基因包含:LOXHD1 8例,MYH13 8例,PIEZO18 例,DNAH5 7 例,DPH1 7 例,USH2A 7 例,DISP1 6 例,LAMB3 6 例,MYO5B 6 例,OASL6 例,SDK2 6 例,ZNF23 6 例,CCDC170 5 例,CHID1 5 例,DIS3L2 5例,GALNT8 例,GCN1 5 例,HTR2B 5 例,KLHL32 5 例,MICAL1 5 例,PRDM25例,SYNE2 5例。与患者移植后不良OS相关的基因有10个:DPH1、USH2A、LAMB3、MYO5B、OASL、CHID1、DIS3L2、GALNT8、GCN1、HTR2B。与移植后不良 RFS 相关的基因有 9 个:LOXHD1、MYH13、SDK2、ZNF23、CCDC170、KHLH32、MICAL1、PRDM2、SYNE2。此外 PIEZO1、DNAH5 及 DISP1 突变是 MDS患者移植后OS及RFS的不良预后因素。3.为进一步验证RAS通路突变在MDS发病中的作用,我们采用NGS技术对211例MDS移植患者51种血液肿瘤驱动基因进行检测。将NGS检测结果中的RAS通路相关基因突变结果与WES结果进行合并。总计303例患者的骨髓样品中,RAS通路突变的病例58例(19.4%),RAS通路突变与患者WHO分型(P<0.001)、初诊原始细胞比例(P=0.001)、IPSS风险(P<0.001)及移植前疾病进展(P=0.003)密切相关,提示RAS通路突变可能参与了 MDS的疾病进展。结论1.驱动基因突变影响MDS患者预后,其中U2AF1、TET2及SETBP1突变与MDS患者移植后不良OS及RFS相关,RUNX1突变与患者不良RFS相关。2.WES技术发现了 22个新的预后相关的驱动基因突变。3.RAS通路突变是影响MDS患者移植后OS及RFS的不良因素,可能参与了疾病的进展。第三部分 Chelidonine对RAS通路突变髓系肿瘤的靶向作用探索背景RAS通路突变在血液肿瘤中有较高的发生率。然而,在血液肿瘤中,除了 FLT3抑制剂,无其他针对RAS通路突变的靶向药物应用于临床。丝氨酸/苏氨酸激酶STK19是一种新发现的激酶,可通过磷酸化的方式激活RAS。在实体肿瘤中发现,Chelidonine可以特异性抑制STK19,靶向RAS信号,发挥抗肿瘤作用。因此我们探索了Chelidonine在RAS通路突变的髓系肿瘤中的作用。方法体外实验中,评估Chelidonine对RAS通路突变型和野生型细胞增殖及凋亡的作用。同时检测了药物处理前后下游通路及基因表达变化。通过构建STK19敲减质粒,探索Chelidonine的作用靶点。此外,建立OCI-AML3及MV4;11细胞系的人源肿瘤细胞系异种移植(cell derived xenograft,CDX)模型,观察Chelidonine的体内治疗效应。结果1.体外实验中,我们证实Chelidonine可显著抑制RAS相关突变细胞系的增殖,对不存在RAS突变的野生型细胞抑制增殖的效应明显减弱。Chelidonine浓度≥2.5μM时可明显增加RAS突变细胞的凋亡比例,同时可诱导凋亡蛋白Caspase 3,Caspase 7和PARP的表达。在OCI-AML3细胞系中,与不用Chelidonine处理的对照组相比,Chelidonine可抑制RAS下游P-MEK,P-ERK及P-AKT的蛋白表达水平,提示Chelidonine通过抑制下游的Raf/MEK/ERK通路和PI3K-AKT通路影响细胞的增殖和凋亡。而在MV4;11细胞中,Chelidonine用药组下游的ERK通路出现反向活化,而PI3K-AKT通路受到抑制。提示在FLT3-ITD突变的MV4;11细胞中,Chelidonine可能主要通过PI3K-AKT通路发生作用。qRT-PCR对HLDA1、DUSP4、ETV4和SPRY2基因表达水平进行了检测。结果发现,在OCI-AML3细胞系,Chelidonine对DUSP4表达的抑制作用最明显,对ETV4、PHLDA1及SPRY2的表达也有不同程度的抑制。2.STK19敲减的OCI-AML3和MV4;11细胞中,细胞凋亡明显增加。在shSTK1 9-OCI-AML3细胞,P-ERK蛋白表达下调,提示STK19通过下游的ERK通路发挥作用。在shSTK19-MV4;11细胞,P-ERK蛋白表达反而上调,提示通过其他的下游通路发挥作用。3.体内实验中,Chelidonine作用于OCI-AML3及MV4;11细胞的CDX模型,可以降低骨髓hCD45+细胞比例,减少骨髓及脾脏的浸润,增加肝脾凋亡蛋白Caspase3的表达,延长NSG小鼠的存活时间,提示Chelidonine有体内抗肿瘤效应。结论1.体外实验中,Chelidonine可以抑制RAS信号,引起RAS通路突变白血病细胞系(包括OCI-AML3、HL-60、MV4;11和SKM-1)的细胞增殖减少,凋亡增加。2.Chelidonine通过靶向STK19在OCI-AML3细胞中发挥抗增殖和诱导凋亡的作用。3.Chelidonine诱导体内细胞凋亡,对OCI-AML3和MV4;11构建的CDX模型有治疗作用。