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研究背景及目的 流行病学和前瞻性临床试验证实纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)是动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)独立危险因子,动物实验和体外研究也证实动脉壁内 Fg 向纤维蛋白(fibrin,Fb)转化与 As 进展、血栓形成及经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄密切相关;但对于 Fg 本身是否为 As 的致病因子目前还存在争议,机制仍不十分清楚。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)由中膜向内膜移行并异常增殖是 As 及再狭窄发病机制中的关键环节。本实验通过观察不同浓度 Fg 及 Fb 对体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞(rat aorta smooth muscle cell,RASMC)增殖和移行的影响,探讨 Fg 本身是否具有直接致As 作用并对 Fg 与 Fb 的作用加以比较。 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是介导细胞外信号与细胞核反应间信息传递的共同通路与中心环节,但关于 MAPK 信号途径在 Fg/Fb 对 VSMC 增殖和趋化中的调控作用目前尚未见报道。因此本研究进一步探讨了 MAPK 3 个亚族:细胞外信号调节激酶(extracellular signal- regulated kinase , ERK ) 、 p38 MAPK 和 c-Jun N 末 端 激 酶 ( c-June N-terminal kinase, JNK)在 Fg/Fb 诱导 VSMC 增殖和趋化过程中的调控作用。 实验方法(1)用胶原酶消化法培养 RASMC,采用免疫荧光染色法对细胞特异性蛋白标志物进行鉴定,同时进行细胞生长曲线测定判断细胞增殖能力及细胞生长动力学特征。(2)根据体内的 Fg 代谢过程,采用凝血酶作用于 Fg 制备Fb。(3)RASMC 的增殖活力采用直接反映细胞数量的细胞计数法和反映细胞DNA 复制能力的 BrdU 掺入法以及反映细胞周期的流式细胞术测定。(4)采用刮伤实验及慢速显微摄像技术测定镜下细胞平均迁移距离,评价 RASMC 随机迁移能力;通过染色计数穿过 Transwell 嵌套装置中多聚碳酸酯膜透膜细胞数,并通过显微镜下动态观察 RASMC 向三维 Fb 胶中的运动评价 Fg/Fb对 RASMC的趋化性,并用 Western 印迹法检测 RASMC 明胶酶 A 的表达,明胶酶谱分析其分泌的明胶酶活性。(5)提取细胞总蛋白,应用 Western 印迹法检测 Fg 及 Fb 对细胞 ERK、p38 和 JNK 表达、活性的影响;应用上述三个信号通路的选择性抑制剂检测各信号通路在 Fg 及 Fb 促 RASMC 增殖、迁移中的作用;提取细胞核蛋白及浆蛋白,应用 Western 印迹法及免疫组织化学方法检测 Fg 对 ERK 活性及亚细胞定位的影响。 实验结果(1)RASMC 特异性标志蛋白 SM α-actin 免疫荧光染色阳性,细胞增殖活力较强,细胞倍增时间约 64 h,可用于细胞增殖和迁移实验。(2)Fg 及Fb 均可促进 RASMC 增殖,相同浓度的 Fb 比 Fg 作用更强,0.2 g/L ～ 3.2 g/L Fg及由其转化而成的 Fb 刺激 RASMC 增殖的作用与 Fg 浓度均呈明显剂量效应关系。(3)Fg 对 RASMC 向随机方向迁移无明显影响,Fg 与 Fb 均对 RASMC 有明显的趋化作用且呈浓度依赖关系;同浓度的 Fb 比 Fg 趋化作用更强,两者对RASMC 的趋化作用与明胶酶 A 的表达及活性上调有关。(4)Fg 以时间依赖性方式诱导 ERK及 p38 活化,Fb 以时间依赖性方式诱导 ERK 、p38 及 JNK活化。(5)ERK 及 JNK 部分参与 Fb 诱导的 RASMC 增殖,JNK 在此过程中的作用更为重要,两者并不参与 Fb 诱导的 RASMC 迁移;p38 激活在 RASMC 向 Fb 胶迁移过程中发挥重要作用,但并不参与 Fb 诱导的 RASMC 增殖。(6)ERK 的磷酸化及核转位与 RASMC 自发性生长的特性密切相关,而且与细胞异质性有关。(7)Fg 刺激后 10 min 至 1 h RASMC ERK 的活化及细胞内转位与其促增殖作用密切相关。 结论 Fb 通过激活细胞 ERK 和 JNK(而不是 p38)信号通路促进 RASMC增殖;通过促进 p38(而不是 ERK 和 JNK)活化诱导 RASMC 趋化;Fg 的促增殖作用与 ERK 的活化及细胞内转位密切相关。上述机制可能在 As 的发生和/或再狭窄的病理发展过程中发挥重要作用。