目的1.研究在探讨肠安Ⅰ号的药效学和对IBS-D大鼠作用机理。2.观察模拟肠安Ⅰ号的中药安慰剂(即含有5%、10%肠安Ⅰ号成分的安慰剂),通过胃肠动力、镇痛、抗炎实验探讨含有5%、10%肠安Ⅰ号成分的安慰剂有无药效学作用以及对D-IBS大鼠有无药理效应。方法一、肠安Ⅰ号对腹泻型肠易激综合征的常规药效学研究方法采用小鼠小肠推进和新斯的明亢进实验来观察肠安Ⅰ号对胃肠动力是否有影响；采用小热板镇痛法和二甲苯致小鼠耳肿胀实验来观察其是否有镇痛抗炎作用。结果在小鼠小肠推进、新斯的明致小肠亢进实验及二甲苯致小鼠耳肿胀实验,肠安Ⅰ号高、中、低剂量组与正常组比较有差异(P<0.05),而3组间两两比较没有差异(P>0.05)；在小鼠热板镇痛实验,在给药后30’、60’、90’、120’时肠安Ⅰ号高、中与正常组比较,能提高痛阈(P<0.01～0.05),而肠安Ⅰ号高、中剂量间没有差异(P>0.05),在给药后30’,肠安工号低剂量的痛阈改变与正常组比较没有差异(P>0.05)。二、肠安Ⅰ号对IBS-D大鼠的作用机理研究方法：Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、肠安Ⅰ号高、中、低剂量组、得舒特组共6组,每组10只。实验前10小时禁食,自由饮水。除了正常组分别以番泻叶(0.3g／mL)灌胃(按20ml/kg),每日1次,在灌服完番泻叶煎剂1小时后即用粗制棉绳束缚大鼠的两肢,使之行动不便,烦躁不安,造成一定的刺激,持续2小时,连续2周。造模后给药,正常组：每日只予0.5%羧甲基纤维素(CMC)配制成的混悬液(20ml/kg).其余各组按上法造模,2周后在灌服番泻叶后60分钟给药：肠安Ⅰ号高、中、低剂量组给药剂量分别为22.6g／kg、11.3g／kg、5.7g／kg,得舒特组予以得舒特灌胃,给药的体积均为20ml/kg,每日1次,连续2周。分别在大鼠内脏高敏感性、腹泻指数、炎性介质、免疫功能、病理变化和炎性介质蛋白表达等几方面探讨肠安Ⅰ号及其低浓度原药安慰剂对IBS-D大鼠的部分机理研究。实验一肠安Ⅰ号对D-IBS大鼠内脏高敏感性的影响采用腹壁撤退反射(AWR)评分测定各组大鼠在20、40、60、80 mmHg直结肠扩张压力下疼痛反应,观察肠安Ⅰ号对IBS大鼠内脏高敏感的影响。实验二肠安工号对D-IBS大鼠血清炎性细胞因子的影响采用典型的夹心法酶联免疫吸附测定法,血清IL-10、TNF-α测定步骤严格按试剂盒说明的要求进行。实验三肠安Ⅰ号对IBS-D大鼠免疫功能的影响实验结束后,各组大鼠禁食24h,称体重,并计算胸腺和脾脏指数。实验四肠安Ⅰ号对腹泻型IBS大鼠结肠粘膜肥大细胞的影响用ALLen中性红染色法观察各组大鼠结肠粘膜MC的个数、面积、周长、直径。实验五肠安Ⅰ号对腹泻型IBS大鼠结肠粘膜NF-κB及其蛋白表达的影响免疫组化和westernbloting印迹方法测定大鼠结肠粘膜NF-κB的含量及其蛋白表达结果(1) D-IBS模型的建立1)外观体重的变化：大鼠出现便溏、皮毛松弛、四肢无力、活动减少、消瘦等现象。模型组动物体重增长缓慢,造模1、2周后,均与正常组比较差异显著(P<0.05)。2)造模后第1天,各实验组的腹泻指数与正常组比较有统计学意义(P<0.01),而实验组间没有统计学意义,提示造模成功；而治疗7天后,肠安Ⅰ号各剂量组腹泻指数减少与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。3)各实验组在造模后第1天不同直结肠扩张(CRD)压力下与正常组比较AWR评分有显著的统计学意义(P<0.05-0.01),提示腹泻型肠易激综合征大鼠模型的建立。4)大鼠结肠粘膜HE染色结果结肠粘膜完整,中药和西药组有两只大鼠结肠粘膜HE染色可见粘膜下层轻度血管扩张,未见粘膜器质性损害及炎性细胞浸润。5)模型组的胸腺、脾脏指数均比正常组低(P<0.01-0.05)6)模型组大鼠血清TNF-α的含量明显高于正常组(P<0.01),血清IL-10含量低于正常组(P<0.05),提示造模后TNF-α升高、IL-10含量降低。(2)对IBS-D大鼠内脏高敏感性的影响在结直肠扩张20 mmHg下肠安Ⅰ号中、低剂量组AWR与模型组比较(P>0.05),差异无统计学意义,对大鼠内脏高敏感性没有降低,高剂量组AWR与模型组比较(P<0.01),在40、60.80 mmHg下中药对照组肠安工号高、中、低剂量组AWR与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01～0.05),并呈一定的量效关系。(3)对IBS-D大鼠血清炎性细胞因子的影响治疗结束后肠安工号TNF-α高剂量组含量降低,与模型组比较有差异(P<0.01),中、低剂量组含量降低与模型组比较有差异(P<0.05)；模型组血清IL-10含量低于正常组(P<0.05),经治疗结束后肠安工号高、中、低剂量组的IL-10含量增高,与模型组比较有差异(P<0.05)；血清IL-10的含量与模型组比较没有差异(P>0.05)。(4)对IBS-D大鼠免疫功能的影响1)体重：肠安Ⅰ号高、中、低剂量组分别在治疗第1、2周可明显增加大鼠的体重,与模型组比较有明显提高,差异显著(P<0.05或P<0.01)。2)胸腺、脾脏：治疗结束后肠安Ⅰ号高、中、低剂量组的胸腺、脾脏指数的增高与模型组比较有差异(P<0.05),高、中、低剂量和得舒特组两两比较没有差异。(5)对IBS-D大鼠结肠粘膜肥大细胞的影响模型组与正常组比较各组大鼠结肠粘膜MC数目明显增多,直径、面积、周长增加提示造模各组MC在腹泻型肠易激综合征表达增多；肠安Ⅰ号高、中、低剂量组和得舒特组MC的数目、直径、面积、周长的减少与模型组比较有统计学意义(P<0.05),肠安Ⅰ号高、中低剂量组与得舒特组比较没有统计学意义(P>0.05)。(6)对IBS-D大鼠结肠粘膜NF-κB及其蛋白表达的影响1)结肠免疫组化NF-κB结果：正常组大鼠NF-κBP65表达为无或弱阳性,为棕黄色,以胞质着色为主；与正常组相比,模型组大鼠结肠粘膜组织可见大量NF-κBP65大量表达,胞质和胞核都有表达,以核着色为主,肠安Ⅰ号高、中、低剂量组和得舒特组经过治疗后10D(光密度值)降低与模型组比较有统计学意义(P<0.05),以胞质着色为主,高、中、低剂量和得舒特组两两比较没有差异。2) NF-κB Westernblot结果显示：模型组的蛋白表达量比正常组高,提示造模后大鼠的结肠粘膜炎性活化(P<0.05),治疗结束后肠安Ⅰ号高、中、低剂量组的蛋白表达量的降低与模型组比较有差异(P<0.05),高、中、低剂量和得舒特组两两比较没有差异。三、含低浓度原药安慰剂对肠易激综合征的常规药效学研究方法采用小鼠小肠推进和新斯的明亢进实验来观察中药安慰剂对胃肠动力是否有影响；采用小鼠热板镇痛法和二甲苯致小鼠耳肿胀实验来观察中药安慰剂是否有镇痛抗炎作用。结果在小鼠小肠推进、新斯的明致小肠亢进实验及二甲苯致小鼠耳肿胀实验,安慰剂、含5%、含10%肠安Ⅰ号成分组与正常组比较无差异(P>0.05)。在小鼠热板镇痛实验,在给药后30,、60’、90’、120’时,含5%、10%肠安Ⅰ号组的痛阈改变与正常组比较没有差异(P>0.05)。四、含低浓度肠安Ⅰ号原药安慰剂对大鼠实验性腹泻型肠易激综合征的效应方法(一)对实验性腹泻型肠易激综合征大鼠内脏高敏感性的影响观察各组大鼠在20、40、60、80 mmHg下行直肠扩张,采用腹壁撤退反射(AWR)评分测定各组大鼠在20、40、60、80 mmHg直结肠扩张压力下疼痛反应,观察含低浓度肠安Ⅰ号原药安慰剂对IBS大鼠内脏高敏感性的影响。(二)对实验性D-IBS大鼠血清炎性细胞因子的影响采用典型的夹心法酶联免疫吸附测定法,血清IL-10、TNF-α测定步骤严格按试剂盒说明的要求进行。(三)对实验性IBS-D大鼠免疫功能的影响实验结束后,各组大鼠禁食24h,称体量。摘去脾脏和胸腺,滤纸去湿,电子天平称重。计算胸腺和脾脏指数,脏体指数=脏器质量／终末体质量×100%(四)对实验性腹泻型IBS大鼠结肠粘膜肥大细胞的影响用ALLen中性红染色法观察各组大鼠结肠粘膜MC的个数、面积、周长、直径。每张切片至少分析3个视野,每组数据至少10个。(五)对实验性腹泻型IBS大鼠结肠粘膜NF-κB及其蛋白表达的影响抗NF-κB单克隆抗体及免疫组化方法观察NF-κB在IBS大鼠结肠粘膜上的表达。按western印迹方法测定蛋白表达,以P65蛋白表达为参照,与β-actin蛋白表达量的比值作为组织内蛋白的相对表达水平。结果(1)对实验性IBS-D大鼠内脏高敏感性的影响经过2周治疗后模型组的内脏敏感性与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05～0.01),提示模型组内脏高敏感性建立；阳性药对照组得舒特AWR评分与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01),在结直肠扩张20 mmHg下低剂量组AWR与模型组比较(P>0.05),差异无统计学意义,对大鼠内脏高敏感性没有降低,含5%、10%肠安Ⅰ号在不同CRD下大鼠AWR评分与模型组比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。(2)对IBS-D大鼠血清炎性细胞因子的影响模型组大鼠血清TNF-α的含量明显高于正常组(P<0.01),提示造模后TNF-α含量升高,治疗结束后含5%、10%肠安Ⅰ号组TNF-α含量与模型组比较没有差异(P>0.05)。模型组血清IL-10含量低于正常组(P<0.05),经治疗结束含5%、10%肠安Ⅰ号组血清IL-10的含量与模型组比较没有差异(P>0.05)。(3)对IBS-D大鼠免疫功能的影响1)体重：含5%、10%肠安Ⅰ号组的胸腺指数、脾脏指数变化与模型组比较没有差异(P>0.05)。2)胸腺、脾脏：治疗结束后含5%、10%肠安工号组的胸腺指数、脾脏指数变化与模型组比较没有差异(P>0.05)。(4)对IBS-D大鼠结肠粘膜肥大细胞的影响模型组与正常组比较各组大鼠结肠粘膜MC数目明显增多,直径、面积、周长增加提示造模各组MC在腹泻型肠易激综合征表达增多；治疗结束后5%、10%肠安Ⅰ号组与模型组比较没有统计学意义(P>0.05)。(5)对IBS-D大鼠结肠粘膜NF-κB及其蛋白表达的影响1)结肠免疫组化NF-κB结果：正常组大鼠NF-κBP65表达为无或弱阳性,以胞质着色为主；与正常组相比,模型组大鼠结肠粘膜组织可见大量NF-κBP65大量表达,胞质和胞核都有表达,以核着色为主。治疗结束后5%、10%肠安Ⅰ号IOD(光密度值)降低与模型组比较没有统计学意义(P>0.05)。2) N F-κBWesternblot结果显示：模型组的蛋白表达量比正常组高,提示造模后大鼠的结肠粘膜炎性活化(P<0.05),含5%、10%肠安Ⅰ号组的NF-κB蛋白表达量变化与模型组比较没有差异(P>0.05)。结论肠安Ⅰ号高、中、低剂量组及其低浓度原药安慰剂在胃肠动力、镇痛和抗炎实验中,以及在研究对IBS-D大鼠内脏敏感性、腹泻指数、炎性细胞因子TNF-α、IL-10以及结肠免疫组化NF-κB及其表达的影响,结果显示肠安Ⅰ号高、中、低剂量组有药效学作用,并从以上指标各组与模型组比较,结果显示可通过以上指标来阐述肠安Ⅰ号治疗IBS-D大鼠的部分作用机理。5%、10%没有以上药效学作用,对IBS-D大鼠关于以上指标没有药理活性,可起到中药安慰剂对照作用。本文先对肠安Ⅰ号及其低浓度原药安慰剂的药效学研究然后对IBS-D大鼠模型进行部分机理研究,在用多因素(番泻叶联合传统束缚方法)共同作用下,从不同因素角度协同诱导IBS-D的产生,主要通过IBS-D低度炎症病理特点研究展开,肠道低度炎症存在炎性细胞因子,并在NF-κB激活,引起内脏敏感性、胃肠动力异常,从而来阐释了肠安Ⅰ号对IBS-D大鼠的部分发病机理。