刺参和海胆SoxE基因克隆、表达及功能初探

来源 :大连海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:h462r5134dg
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刺参(Apostichopus japonicus)隶属于棘皮动物门,游移亚门,海参纲,盾手目,刺参科。近五年我国刺参的养殖产量约占全国海水养殖经济总量的1%,其产值占全国海水养殖总产值的12.9%。刺参在个体生长速度、免疫力及附加经济价值上呈现显著的性别差异。光棘球海胆(Mesocentrotus nudus)隶属于棘皮动物门,海胆纲,拱齿目,球海胆科。海胆是我国一个重要的海水养殖种,性腺是唯一可食用和最具经济价值的部分,雄性海胆在生长速度、免疫能力、性腺营养成分等方面具有明显优势。目前,包括刺参和海胆在内的棘皮动物性腺发育机制仍是谜团。挖掘性腺发育相关基因是解析性腺发育机制的有效途经之一。研究表明,Dmrt1和Sox E基因在脊椎动物雄性个体的性别决定、性腺分化与维持中发挥重要调控作用。无脊椎动物中,针对Dmrt1和Sox E基因功能及互作关系的研究较少。本研究首先通过同源比对分别在基因组和性腺转录组中鉴定了刺参和光棘球海胆的Sox E基因序列,随后利用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆其c DNA全长并分析其分子特征和进化关系,接着通过荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)阐明其在成体不同组织、不同性腺发育时期和胚胎发育时期的动态表达变化,最后利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)解析刺参Sox E基因在精巢发育中发挥的功能,并探索了刺参中Dmrt1基因和Sox E基因的互作关系。主要研究结果如下:(1)光棘球海胆Sox E基因(Mn Sox E)c DNA全长为2687bp,5’-UTR 470 bp,3’-UTR 726bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)1491 bp,共编码496个氨基酸。结构域预测结果表明,Mn Sox E预测蛋白质序列第96-166个氨基酸残基之间具有1个保守的HMG结构域。(2)刺参Sox E基因(Aj Sox E)c DNA全长为3389bp,5’-UTR 275 bp,3’-UTR 1734 bp,ORF 1491 bp,共编码496个氨基酸。结构域预测结果表明,Aj Sox E预测蛋白质序列第85-155个氨基酸残基之间也包含1个保守的HMG结构域。(3)光棘球海胆Sox E基因在性腺组织中表达量最高,其中精巢中的表达量是卵巢中的5.05倍,在管足和肠中少量表达。此外,Mn Sox E在早期胚胎发阶段不表达,当发育至4-腕幼虫时开始检测到其转录本。(4)刺参Sox E基因在管足中表达量最高,在卵巢、纵肌和呼吸树中也能检测到大量转录本。与脊椎动物不同,刺参Sox E基因在卵巢中表达量显著高于精巢,卵巢中的表达量是精巢中的34.75倍,且在不同性腺发育阶段其表达量有显著差异。此外,胚胎发育至囊胚期可检测到刺参Sox E基因的大量转录本。(5)利用RNAi在雄性刺参中干扰Sox E基因表达,发现敲降Sox E后Dmrt1基因的表达急剧下降,下降到几乎无法检测到的水平,且生殖细胞标记基因piwi的表达量也显著下降,但是处于雌性性别分化通路中的foxl2基因表达量显著上升。敲降刺参Dmrt1基因,导致精巢中Sox E的表达量下调(45.52%—88.65%),同时piwi的表达量下调(0.97%—58.36%),foxl2基因表达量上调(66.75%—117.41%)。综上,本研究阐明了光棘球海胆Sox E的分子特征和表达特性,揭示了其分子特征在进化上高度保守,在精巢和卵巢组织中差异表达,意味着Sox不仅在光棘球海胆精巢发育中发挥作用还可能在卵巢发育中也起重要作用。与光棘球海胆Sox E基因相似,刺参Sox E的分子在进化中保守,意外的是其在卵巢中表达量显著高于精巢,说明Sox E基因可能在刺参卵巢和精巢发育中均发挥重要调控作用。在雄性刺参中敲降Sox E基因引起Dmrt1基因和piwi基因表达下调,foxl2表达上调,意味着Aj Sox E在维持精巢分化状态中至关重要。有趣的是,在雄性刺参中敲降Dmrt1基因也会引起Sox E基因和piwi基因表达下调,foxl2表达上调,说明Dmrt1基因和Sox E基因间的相互作用在维持刺参精巢分化及发育发挥重要调控作用。本研究为解析棘皮动物的性别决定和分化机制奠定了基础。
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