论文部分内容阅读
目的检测卵巢癌细胞株SKOV3中骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和其他转移相关基因尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)和乙酰肝素酶(heparanase,HPA)的表达,研究OPN对卵巢癌侵袭转移潜能的影响并初步探讨其可能机制。材料与方法卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3细胞复苏后常规培养于含有10%小牛血清的RPMI1640培养液中,用0.25%的胰酶消化传代。用脂质体Lipofectamine 2000介导转染重组质粒pcDNA3.1(-)/OPN,同时转染空载体pcDNA3.1(-)作为对照,并利用G418筛选获稳定转染细胞株。用逆转录聚合酶链反应RT-PCR检测OPNmRNA表达水平,Touching凝胶成像系统分析条带灰度值,并与β-actin相比较计算结果以分析OPN表达强度。用Western-blot检测OPN蛋白表达,用DAB显色盒显示蛋白条带。采用Touching凝胶成像系统软件测定Western-blot条带净灰度值,并与内参结果比较,计算其比值。以无血清培养液培养细胞,在4℃、12000r/min的条件下,离心5min,分取各组细胞上清液用ELISA测定OPN、uPA及HPA的表达,用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。并采用基质凝胶侵袭实验检测两组细胞侵袭力,甲醇固定,伊红染色,以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。实验结果率的比较采用x~2检验,两样本间均数比较行t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、RT-PCR结果示重组质粒转染组OPN的相对表达量(1.268±0.046)明显高于空质粒转染组(0.550±0.027),差异有统计学意义(P＜0.01)。Western-blot检测OPN蛋白表达,重组质粒转染组OPN的蛋白表达(0.642±0.079)较空白质粒转染组高(0.371±0.033),差异有统计学意义(P＜0.01)。2、ELISA法检测细胞培养上清液,重组质粒转染组OPN为(3.605±0.205)ng/ml,空白质粒对照组为(1.602±0.119)ng/ml,两组差异有统计学意义(P＜0.05);重组质粒转染组uPA为(5.342±0.031)ng/ml,空白质粒对照组为(1.956±0.047)ng/ml,两组差异有统计学意义(P＜0.05);重组质粒转染组HPA为(2.762±0.145)ng/ml,空白质粒对照组为(2.692±0.140)ng/ml,两组差异无统计学意义(P＞0.05)。3、基质凝胶侵袭实验重组质粒转染组细胞透膜细胞数为(36.459±4.447),空白质粒对照组细胞透膜细胞数为(18.128±6.017),差异有统计学意义(P＜0.05)。结论1、OPN对卵巢癌细胞的侵袭潜能有促进作用。2、OPN可能通过上调uPA的表达以促进卵巢癌细胞的侵袭转移。3、可为进一步探寻以OPN为靶点的卵巢癌侵袭转移的治疗和进一步的实验研究提供有效的理论依据。