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噪声性听力损失(noise-induced hearing loss,NIHL)是由于长期暴露在噪声环境中所引起的感音性耳聋,是最常见的职业病之一,NIHL目前尚无有效的治疗方法,根本原因在于耳蜗外毛细胞(Outer hair cells,OHCs)受到噪声的损害发生不可逆性死亡,Prestin蛋白是耳蜗OHCs特有的重要感音功能蛋白,是OHCs电运动以及耳蜗放大效应的分子基础,并在OHCs损伤时呈代偿性升高弥补听力损失。目的通过构建耳蜗毛细胞重组Prestin腺相关病毒-2(AAV-2)载体,为耳蜗Prestin蛋白调控研究提供工具,同时构建一种新型无创的内耳基因转染系统。方法以豚鼠Prestin基因为模板,PCR扩增与提取,利用基因工程技术构建AAV-2-Prestin载体,转染培养的耳蜗毛细胞(HEI-OC1细胞株)后1d、3d、5d采用Western blot检测Prestin的表达水平。将构建好的重组Prestin腺相关病毒2型载体,与原位凝胶混合后经鼓膜穿刺鼓室给药的圆窗途径转染豚鼠内耳,免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布,耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和Prestin的表达及分布,WB检测基底膜Prestin表达水平。结果构建pAAV-EGFP-Prestin原病毒质粒转染HEK-293T细胞后,第1d可见微弱绿色荧光蛋白表达,第3d可见绿色荧光蛋白表达达到高峰;AAV-2-Prestin病毒转染HEI-OC1细胞后,不同转染时间的各组Prestin蛋白表达水平显著增高(F=414.755,P<0.001),3d和5d组Prestin蛋白表达显著高于1d(P<0.001),3d组Prestin蛋白表达显著高于5d组(P<0.001)。豚鼠耳蜗给药后第7天开始出现绿色荧光蛋白表达,绿色荧光蛋白分布于耳蜗血管纹、前庭膜、基底膜和Corti器;基底膜铺片显示外毛细胞出现绿色荧光蛋白表达,未见于内毛细胞,14天绿色荧光蛋白表达水平明显增加;豚鼠耳蜗给药后第7天外毛细胞Prestin蛋白表达水平开始增加,14天后增加更显著(P<0.05),内毛细胞未发现Prestin蛋白的表达。WB检测各组基底膜Prestin蛋白表达水平结果,方差分析结果显示具有统计学差异(F=3644.6729,P<0.05),组间比较发现对照组与4天组无显著性差异(P>0.05),7天组Prestin蛋白表达水平明显高于对照组和4天组(P<0.05),14天组Prestin蛋白表达水平明显高于其它各组(P<0.05)。结论重组腺相关病毒-2-Prestin载体成功构建,具有较好的OHCs转染靶向性和持续性,原位凝胶混合重组相关病毒载体经鼓膜穿刺圆窗途径转染内耳毛细胞是一种新型无创内耳基因转染系统。