肝纤维化(Hepatic fibrosis, HF)是各种不同致病因素引起慢性肝病进而发展为肝硬化的共有病理改变和必经途径，是肝脏对各种慢性损伤产生的一种修复反应。其主要病理特征是以胶原为主的细胞外间质(extracellular matrix, ECM)在肝组织内的过度合成和异常沉积。肝纤维化是可逆的，而肝硬化则难以逆转。因此，阻止甚至逆转肝纤维化是治疗各种慢性肝病、预防其向肝硬化发展的关键所在。对于肝纤维化的防治，迄今尚乏真正有效治疗手段，深入研究肝纤维化的发病机制进而探索有效防治措施，对于治疗各种慢性肝病，预防其向肝纤维化、肝硬化发展有着重要意义。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)是肝纤维化发生过程中产生ECM的主要细胞，HSCs活化是肝纤维化形成的细胞学基础，在肝纤维化发展过程中扮演重要角色。静止状态下，HSCs胞浆内富含脂滴，已有研究表明脂滴的存在能抑制HSCs的活化，而HSCs活化的最具特征性表现是胞浆内脂滴的丢失，转化为肌成纤维细胞，并主要通过两种作用机制促进肝纤维化进程：以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的ECM成分生成过多，降解不足；合成并释放一些重要的促进纤维化发生、慢性炎症和血管生成的细胞因子。近来，Friedman等研究发现，在HSCs活化过程中，胞浆内脂滴的丢失与自噬(autophagy)相关，自噬可通过降解脂滴为HSCs活化提供能量。相反，抑制自噬可减少HSCs活化并降低其纤维生成能力，主要表现为α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、Ⅰ型胶原等表达下降。自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，进一步降解其所包裹的多余的蛋白质和亚细胞成分，以实现细胞本身代谢需要和某些细胞器的更新，维持自身的稳定。自噬的整个过程主要分为3个阶段：自噬体的初步形成；自噬体膜的延伸；自噬体与溶酶体融合并降解。氯喹(Chloroquine, CQ)可通过升高溶酶体内PH值，阻止自噬体与溶酶体的结合而抑制自噬。目前国内外对自噬在肝纤维化中的研究主要侧重于其对肝星状细胞活化的影响，而自噬对活化后的HSCs的生物学作用尚缺乏研究报道。本实验以此为出发点，研究应用不同浓度的自噬抑制剂CQ干预活化的HSC-T6细胞后，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达及基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase, MMPs）、基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitionof matrix metalloproteinase, TIMPs）的表达变化，旨在完善自噬对HSCs胶原代谢的影响。目的：研究不同浓度的自噬抑制剂CQ对活化HSC-T6的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响以及该过程中MMP-2、TIMP-2、MMP-13和TIMP-1的表达变化。方法：应用TGF-β1刺激大鼠肝星状细胞系HSC-T6，使其处于完全活化状态，给予不同浓度的CQ干预24h。实验分组如下：①Control组，仅以含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞，在TGF-β1刺激步骤加入等体积TGF-β1的溶剂枸橼酸钠溶液；②TGF-β1组，以含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞，待70%融合后加入终浓度为20ng/ml的TGF-β1；③TGF-β1+CQ15μmol/L组，在给予TGF-β1刺激的同时加入浓度为15μmol/L的CQ干预；④TGF-β1+CQ30μmol/L组，在给予TGF-β1刺激的同时加入浓度为30μmol/L的CQ干预；⑤TGF-β1+CQ60μmol/L组，在给予TGF-β1刺激的同时加入浓度为60μmol/L的CQ干预。采用MTT法检测细胞活力；Western blot技术检测自噬标识蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和P62蛋白的表达情况；免疫细胞化学检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的定位表达量；Western blot技术检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-2、TIMP-2、MMP-13和TIMP-1蛋白的表达；Real-time Q-PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-2、TIMP-2、MMP-13和TIMP-1基因水平的表达变化。结果：①用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞，待70%融合后加入TGF-β1，浓度分别为5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml，干预24h后，采用MTT法检测细胞活力并绘制曲线，起始随着TGF-β1浓度的升高细胞活力明显增强，在浓度达到20ng/ml后，继续升高浓度细胞活力增加不明显。因此，选择20ng/ml作为本实验的干预浓度。②应用Western blot技术检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和P62蛋白在上述5组细胞中的表达，其结果显示：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相对表达量依次为0.63±0.08、0.61±0.12、1±0.1、1.5±0.3、2.4±0.17，TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组（P<0.01），TGF-β1+CQ组之间也有显著性差异（P<0.01）；P62蛋白的相对表达量依次为4.4±0.4、4.1±0.33、5.9±0.25、6.2±0.31、6.1±0.43，TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组（P<0.01），而TGF-β1+CQ组之间无显著性差异（P>0.05）。③MTT法检测细胞活力显示：以Control组的细胞活力定义为100%，其余4组分别为115%、89%、48%、27%，TGF-β1组较Control组显著升高，TGF-β1+CQ组较Control组和TGF-β1组均显著下降（P<0.01），TGF-β1+CQ组中随CQ剂量增加，细胞活力下降具有显著性差异（P<0.01）。④Western blot技术检测α-SMA表达，其相对表达量依次为0.84±0.12、1.23±0.21、1.18±0.16、1.2±0.23、1.31±0.33，TGF-β1组和TGF-β1+CQ组均显著高于Control组（P<0.05），而TGF-β1组和TGF-β1+CQ各组之间无显著性差异（P>0.05）。⑤免疫细胞化学染色显示：TGF-β1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量较Control组显著增加，TGF-β1+CQ组较TGF-β1组也有明显增加。⑥应用Western blot技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原在上述5组细胞中的表达，其结果显示：Ⅰ型胶原的相对表达量依次为0.81±0.13、1.12±0.11、1.43±0.17、1.6±0.14、1.95±0.2，TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组（P<0.01），TGF-β1+CQ30μmol/L组显著高于TGF-β1+CQ15μmol/L组（P<0.01），TGF-β1+CQ60μmol/L组显著高于TGF-β1+CQ30μmol/L组（P<0.05）; Ⅲ型胶原的相对表达量依次为0.84±0.15、1.28±0.2、1.84±0.13、3.1±0.23、3.9±0.32，TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组（P<0.01），TGF-β1+CQ各组之间也有显著性差异（P<0.01）。⑦应用Real-time Q-PCR方法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达，其结果显示：以Control组的mRNA表达量为1，Ⅰ型胶原其余4组的相对表达量依次为1.8±0.06、2.1±0.11、2.5±0.08、2.8±0.13，TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组（P<0.05），TGF-β1+CQ各组之间也有显著性差异（P<0.05）；Ⅲ型胶原的相对表达量依次为2.1±0.13、2.7±0.07、3±0.17、3.7±0.09，TGF-β1+CQ组均显著高于TGF-β1组（P<0.05），TGF-β1+CQ各组之间也有显著性差异（P<0.05）。⑧应用Western blot技术检测MMP-2和TIMP-2蛋白的表达，其结果显示：MMP-2蛋白各组的表达量依次为1.01±0.11、0.67±0.08、0.69±0.06、0.71±0.1、0.74±0.09，TGF-β1组和TGF-β1+CQ组较Control组明显下降（P<0.05），但TGF-β1组和TGF-β1+CQ各组之间没有显著性差异；TIMP-2的相对表达量依次为0.87±0.08、1.19±0.13、1.31±0.11、1.58±0.17、1.82±0.16，TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著增加（P<0.05），TGF-β1+CQ各组之间也有显著性差异（P<0.05）。⑨应用Real-time Q-PCR方法检测MMP-2和TIMP-2的mRNA表达，其结果显示：以Control组的mRNA表达量为1，MMP-2其余4组的相对表达量依次为2.61±0.11、2.8±0.1、3.2±0.14、3.8±0.17, TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著增加（P<0.05），TGF-β1+CQ各组之间也有显著性差异（P<0.05）；TIMP-2其余4组的相对表达量依次为1.5±0.03、2.8±0.06、3.6±0.06、4.2±0.02，TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著增加（P<0.05），TGF-β1+CQ各组之间也有显著性差异（P<0.01）。⑩应用Western blot技术检测MMP-13和TIMP-1蛋白的表达，其结果显示：MMP-13蛋白各组的表达量依次为：1.64±0.03、1.27±0.07、0.84±0.1、0.55±0.07、0.46±0.09，TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著下降（P<0.05），TGF-β1+CQ各组之间也有显著性差异（P<0.05）；TIMP-1蛋白各组的表达量依次为：0.84±0.11、1.02±0.09、1.25±0.04、1.48±0.12、1.6±0.05，TGF-β1+CQ组显著高于TGF-β1组（P<0.01），TGF-β1+CQ各组之间具有显著性差异（P<0.01）。○11应用Real-time Q-PCR方法检测MMP-13和TIMP-1的mRNA表达，其结果显示：以Control组的mRNA表达量为1，MMP-13其余4组的相对表达量依次为3.1±0.12、2.2±0.06、1.8±0.03、1.2±0.03，TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著下降（P<0.05），TGF-β1+CQ各组之间也有显著性差异（P<0.05）；TIMP-1的相对表达量依次为2.7±0.05、3.3±0.1、3.8±0.04、4.8±0.07，TGF-β1+CQ组较TGF-β1组显著增加（P<0.01），TGF-β1+CQ各组之间有显著性差异（P<0.05）。结论：自噬抑制剂CQ能显著增加HSCsⅠ、Ⅲ型胶原的表达并呈剂量依赖性，这可能与其上调TIMP-1及TIMP-2的表达，抑制MMP-13的表达有关。