研究背景砷是在自然界中广泛存在的一类重金属类毒性元素,普遍分布于地壳、土壤、水源以及空气中。目前研究已经证实,高浓度砷化物的急性暴露能够引发细胞的基因毒应激反应和氧化应激反应,导致细胞产生损伤效应并诱导细胞发生凋亡。然而,目前对于砷化物引发上述应激损伤效应的具体分子机制尚不十分明确。本课题组在以往研究中发现:生长抑制及DNA损伤诱导基因(growth arrest and DNA damage inducible gene,GADD)45α作为一种重要的砷化物刺激反应蛋白,是砷化物诱导细胞发生凋亡反应的关键介导分子。除砷化物外,GADD45α对紫外线(UV)、电离辐射(IR)等多种应激源也都具有明显反应性,并发挥介导细胞周期行进抑制、DNA损伤修复、诱发衰老及促细胞凋亡等多种生物学功能。本课题组研究结果表明:在正常二倍体细胞及肝癌细胞中都存在有与泛素化修饰反应相关的GADD45α蛋白质稳定性调控机制,从而使得该蛋白在细胞静息状态下维持较低水平。但与UV等反应系统中GADD45α的转录诱导表达机制不同,在砷化物(如As2O3)刺激后,尽管GADD45α基因的转录水平不变,但它可以实现在蛋白质水平的迅速聚集,进而激活其下游信号转导途径而发挥促细胞凋亡功能。因此,GADD45α的蛋白质稳定性改变成为了调控砷化物诱导急性应激损伤效应的关键环节。在进一步的研究中发现:MDM2能够作为GADD45α的E3泛素连接酶调控静息及砷化物刺激条件下GADD45α的蛋白质稳定性,而核糖体小亚基蛋白S7能够在砷化物刺激作用下诱导核糖体应激反应并阻断MDM2所催化的GADD45α组成性泛素化修饰和降解反应进而引发GADD45α在细胞内的聚集。Ik-B激酶β(inhibitor kappa B kinaseβ,IKKβ)作为组成IKK/NF-kB信号通路中蛋白激酶IKK的一个催化亚基,最为人熟知的功能是催化Iκ-Bα的磷酸化并导致其降解,从而释放转录因子NF-κB入核,实现对下游靶基因的转录调控。随着对IKK分子研究的不断深入,发现其功能并不局限于NF-κB通路,由此越来越多的NF-κB非相关性IKK激酶新功能被发现。本课题组在“细胞应激损伤反应中的NF-κB非相关性IKK激酶新功能机制”研究领域开展了长期工作,先后发现了多种由IKKα或IKKβ独立调节的NF-κB非相关性信号蛋白分子及其与IKK激酶协同调控细胞应激损伤反应的系列新机制。我们在砷化物诱导的应激损伤反应机制研究中发现:在as2o3诱导gadd45α表达上调的同时,ikkα与ikkβ的表达水平显著下调;而且这种下调反应是介导砷化物诱导促细胞凋亡效应发生过程中的关键事件,提示gadd45α表达上调和ikkα/ikkβ表达下调之间可能存在一定的功能关联性。因此,本篇论文围绕上述关键科学问题开展了相应的研究工作。目的1、探索ikkβ参与调控gadd45α泛素化修饰和蛋白质稳定性的信号转导途径,进一步明确ikkβ在介导砷化物诱导促细胞凋亡效应中的作用机制。2、探索ikkβ在砷化物诱导细胞凋亡反应中表达水平下调的分子机制,明确ikkβ基因表达调控在其发挥nf-κb非相关性功能中的贡献及机制。方法本研究全部在砷化物敏感型人肝癌细胞株hepg2中进行。我们采用as2o3刺激hepg2细胞不同时间后检测相关蛋白及信号通路的表达及活化水平变化情况。主要采用免疫印迹方法(western-blot)检测信号蛋白如gadd45α、ikkα、ikkβ、mdm2、p53等的表达及活化情况;反转录pcr(rt-pcr)方法检测ikkβ、mdm2、p53等相关基因的mrna表达情况;免疫共沉淀技术(ip)检测ikkβ、mdm2、s7、p53、ets-1等信号蛋白间的相互结合作用;双荧光素酶报告基因技术检测ikkβ基因启动子的转录活化水平;染色质免疫沉淀技术(chip)检测p53、ets-1与ikkβ基因启动子区域的结合活性以及具体结合位点。结果在第一部分研究中我们重点探索了ikkβ参与调控gadd45α的泛素化修饰和蛋白质稳定性的信号转导机制。我们发现:在hepg2细胞中,as2o3诱导gadd45α表达水平上调过程中伴随有ikkα和ikkβ的表达下调反应。敲低ikkβ后,as2o3诱导gadd45α表达上调的趋势较对照组明显增强;过表达ikkβ后则变化趋势相反。敲低或过表达ikkα后,as2o3诱导gadd45α表达上调的趋势较对照组没有明显变化。该结果提示:ikkβ参与调控了砷化物刺激作用下的gadd45α诱导表达反应。我们以往的研究已经证实,gadd45α是as2o3诱导促细胞凋亡效应的关键介导分子。我们在过表达ikkβ后,发现as2o3诱导细胞凋亡比例明显降低,进一步确定了ikkβ能够通过调控gadd45α的诱导表达进而在砷化物诱导促细胞凋亡反应中发挥关键作用。随后,我们发现ikkβ能够参与介导gadd45α的泛素化修饰反应、加速其降解速率并下调其蛋白质稳定性,提示ikkβ是维持静息态细胞中gadd45α低水平表达的重要贡献因素。进而我们发现:ikkβ对gadd45α的稳定性调控作用中不涉及其与s7之间的功能交联,但涉及ikkβ对mdm2表达水平和功能的调控作用。研究结果显示:ikkβ能够下调mdm2的泛素化修饰反应水平、降低其降解反应速率并上调其蛋白质稳定性。这说明ikkβ能够作为mdm2的协同稳定分子进而调控了gadd45α的蛋白质稳定性。在as2o3刺激条件下,ikkβ能够显著增强mdm2的诱导表达水平,同时对其基因转录没有影响。正因为如此,ikkβ实现了对gadd45α诱导表达反应的负向调控作用。而砷化物刺激条件下ikkβ的降解反应可使上述负向调控作用被迫终止并诱导细胞实现gadd45α的诱导表达,推动细胞走向凋亡。以上反应在ikkβ激酶活性缺失后完全丧失。上述结果为本课题组长期开展的“ikk激酶的nf-κb非相关性新功能机制”研究增添了崭新内容。我们在第二部分研究中对as2o3诱导ikkβ表达下调的分子机制进行了详细研究。结果发现:ikkβ的表达下调反应是由于其基因转录被抑制而导致的。我们在分析了ikkβ基因的启动子序列后,发现该启动子序列中含有3个p53结合位点以及2个ets-1结合位点。此前有报道称,p53与ets-1能够协同调控ikkα的转录抑制。因此,我们推测这二者在砷化物诱导的ikkβ转录抑制中也能够发挥作用。后续实验结果证明:砷化物刺激能够引发p53活化及其下游靶基因ets-1表达。敲低p53或ets-1后,as2o3诱导ikkβ基因表达水平下调的反应几乎被完全阻断,说明p53和ets-1的确参与调控ikkβ基因的表达下调反应。随后,我们采用免疫共沉淀技术检测到砷化物刺激条件下的p53/ets-1之间的诱导性结合反应,提示二者在调控ikkβ基因表达下调过程中可能存在协同作用。染色质免疫沉淀和荧光素酶报告基因分析系统进一步证实了p53和ets-1在砷化物刺激作用下可结合于ikkβ基因启动子区域的特定功能位点;这些位点的突变可导致p53和ets-1对ikkβ基因的转录抑制作用完全丧失。综合以上结果,我们揭示了由p53和ets-1协同介导的ikkβ基因转录抑制反应机制,为ikk激酶本身的基因表达调控机制研究提供了崭新发现。结论本论文研究结果揭示了ikkβ是e3泛素化连接酶mdm2的新型协同稳定因子,它可通过增强mdm2的蛋白质稳定性进而实现对gadd45α表达反应的负向调控作用;砷化物刺激条件下则表现为ikkβ通过上调mdm2的诱导表达水平从而抑制gadd45α在细胞内的聚集以及由此而引发的细胞凋亡效应。但砷化物刺激可通过诱导p53活化及其靶基因ets-1表达从而协同介导ikkβ基因的转录抑制反应,该反应的结果是迫使ikkβ对gadd45α的诱导表达及细胞凋亡效应的拮抗作用消除从而推动细胞走向凋亡。p53-Ets-1-IKKβ-MDM2-GADD45α信号途径的诱导活化在介导砷化物诱导促细胞凋亡反应中具有重要作用。