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[目的]通过对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者抗病毒治疗前及抗病毒治疗后外周血辅助性T淋巴细胞17(T Helper 17 cells,Th17)和调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)及其特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(Retinoid-related orphan nuclear receptor yt,RORyt)和叉头/翅膀状螺旋转录因子 3(Forkhead/wingedhelixfamily transcription factor 3,Foxp3)的 mRNA 表达水平以及相关细胞因子白介素-10(Interleukin-10,IL-10)、白介素-17(Interleukin-17,IL-17)、白介素-23(Interleukin-23,IL-23)和转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)的水平的检测,结合分析乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)标志物(HBsAg,HBsAb,HBeAg,HbeAb,HBcAb)及 HBV 复制水平和肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransteras,AST)、总胆红素(Total Bilirubin,TBIL),通过研究和分析以上指标,探讨RORyt和Foxp3 mRNA表达对慢性乙型肝炎患者Th17/Treg失衡的影响,及其与抗病毒治疗应答的相关性。[方法]本研究选取2016年10月至2018年10月期间来昆明医科大学第一附属医院感染科门诊就诊和住院收治的HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者共76例,其中男性48例,女性28例。所有患者均给予恩替卡韦(Entecavir,ETV)0.5mg/d抗病毒治疗48周。同时以来我院的健康体检者22例作为健康对照组,包括男性14例,女性8例。使用流式细胞术(flow cytometer,FCM)检测外周血Th17以及Treg细胞分别占CD4+T细胞所占比例;运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time PCR,RT-qPCR)法测定外周血 Foxp3mRNA 和 RORytmRNA 表达水平;采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immuno-adsordent assay,ELISA)法检测 IL-10,IL-17,IL-23,TGF-β1 水平;采用 ELISA 法测定 HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb 水平;采用实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR)分析仪测定患者血清HBV-DNA载量;采用全自动生化分析仪检测ALT,AST,TBIL等肝功能指标。应用SPSS 17.0统计学软件对所有数据进行统计分析。[结果]1.CHB患者76例,平均年龄为35.54±7.05岁;全部患者均为HBeAg阳性的CHB患者,平均HBV DNA载量为7.68±0.92(Log10,IU/mL),其中HBVODNA≥107IU/mL的患者比例为82%(62/76);肝功能指标ALT,AST,TBIL分别为 205.42±96.58(IU/L),140.26±62.89(IU/L),16.09±5.44(μmol/mL)。2.CHB患者治疗前基线外周血Th17细胞、Treg细胞、RORytmRNA、Foxp3mRNA、IL-17、IL-23、IL-10和TGFβ1水平均显著高于对照组,差异均有统计学意义。与低病毒载量(HBVDNA<107IU/mL)CHB患者相比,高病毒载量(HBVDNA≥107IU/mL)CHB 患者外周血 Th17 细胞,Treg 细胞,RORγtmRNA,Foxp3mRNA,IL-17,IL-23,IL-10和TGFβ1水平均显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.001)。高病毒载量组CHB患者的Th17/Treg失衡明显重于低病毒载量组CHB患者。CHB患者RORγt和Foxp3 mRNA的高表达和Th17/Treg失衡的程度与HBV病毒复制水平的高低有关。3.CHB患者抗病毒治疗期间的病毒学、生化学和免疫学应答情况。CHB患者抗病毒治疗12,24,48周时,HBVDNA转阴率分别为31.6%(24/76),46.1%(35/76)和 81.6%(62/76);HBeAg 转阴率分别为 14.5%(11/76),19.7%(15/76)和 31.6%(24/76);HBeAg 血清学转换率分别为 10.5%(8/76),14.5%(11/76)和 13.2%(10/76);ALT 复常率分别为 55.3%(42/76),77.6%(59/76)和 96.1%(73/76);HBV DNA 载量由 7.68±0.92(Log10,IU/mL)分别降至 4.88±0.86、4.14±0.72和3.73±0.55。CHB患者抗病毒治疗48周时,外周血Th17细胞、Treg细胞、RORγtmRNA、Foxp3mRNA、IL-17、IL-23、IL-10 和 TGFβ1 水平均较治疗前显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.001)。经过ETV抗病毒治疗48周后,CHB患者的病毒学、生化学和免疫学指标均获得显著改善。CHB患者抗病毒治疗期间,随着HBV复制受到抑制,病毒复制水平显著下降,特异性转录因子RORyt和Foxp3 mRNA的高表达和其他相关免疫指标明显下降,Th17/Treg失衡可获得明显改善。4.根据CHB患者在抗病毒治疗48周时不同病毒学应答情况分为:病毒学应答组和部分病毒学应答组二个组。两组患者的基线指标分析结果显示,与部分病毒学应答组相比,病毒学应答组CHB患者基线的外周血Th17细胞、Treg细胞、RORyt、Foxp3mRNA、IL-17、IL-23、IL-10 和 TGFβ1 水平均显著低于部分病毒学应答组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。病毒学应答组CHB患者基线HBV DNA载量水平低于部分病毒学应答组。病毒学应答组CHB患者基线ALT、AST、TBIL水平与部分病毒学应答组无显著性差异(均P>0.05)。病毒学应答组CHB患者的基线RORyt和Foxp3mRNA的高表达及Th17/Treg失衡状况显著轻于部分病毒学应答组CHB患者。也即,那些具有较高病毒复制水平的CHB患者,存在着更显著的RORyt和Foxp3mRNA高表达及Th17/Treg失衡状况。病毒学应答组和部分病毒学应答组,两组CHB患者治疗48周时,外周血Th17 细胞、Treg 细胞、RORyt、Foxp3mRNA、IL-17、IL-23、IL-10 和 TGFβ1水平均较治疗前显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,0.001)。两组CHB患者抗病毒治疗48周后的病毒学、生化学和免疫学指标均获得显著改善。病毒学应答组CHB患者的RORyt和Foxp3mRNA高表达及Th17/Treg失衡状况的改善优于部分病毒学应答组CHB患者。也即,那些RORγt和Foxp3mRNA高表达及Th17/Treg失衡状况较轻的患者,更能获得较好的ETV抗病毒治疗的病毒学应答效果。5.根据抗病毒治疗48周时e抗原血清学应答状况将CHB患者分为三个不同血清学应答组,即HBeAg+组、HBeAg-/HBeAb-组和HBeAg-/HBeAb+组,三组CHB患者治疗48周时外周血Th17细胞、Treg细胞、RORγtmRNA、Foxp3mRNA、IL-17、IL-23、IL-10和TGFβ1水平均较治疗前显著降低,差异均有统计学意义。三组CHB患者抗病毒治疗48周后的病毒学、生化学和免疫学指标均获得显著改善。6.CHB患者治疗前基线相关免疫指标Th17、Treg、RORyt、Foxp3mRNA、Treg与Th17之间比值相关细胞因子和HBVDNA载量和肝功能指标间的相关性分析。CHB患者外周血Th17细胞分别与AST水平、RORytmRNA、Treg、HBV-DNA、IL-17和IL-23水平呈正相关,差异有统计学意义;但与ALT、TBIL水平无明显相关关系(P>0.05)。CHB患者Treg细胞分别与ALT、HBV-DNA、Foxp3mRNA、IL-10、TGFβ1水平呈正相关,差异有统计学意义;但与AST、TBIL水平无明显相关关系(P>0.05)。CHB患者RORγtmRNA水平均与ALT水平、HBV-DNA 水平、Foxp3mRNA、IL-17 和 IL-23 呈正相关;与 AST、Treg 与 Th17比值呈负相关,差异有统计学意义;与TBIL水平无相关性(P>0.05)。CHB患者 Foxp3mRNA 水平分别与 ALT、AST、TBIL、HBV-DNA 水平、IL-10、TGFβ1呈正相关,与Treg与Th17比值呈负相关,差异有统计学意义。CHB患者Treg与Th17比值与HBV-DNA、RORyt、Foxp3呈负相关,差异有统计学意义;但与ALT、AST、TBIL 无明显相关(P>0.05)。CHB 患者 RORyt 和 Foxp3mRNA 高表达与Th17/Treg失衡程度呈显著正相关。RORyt和Foxp3mRNA高表达及Th17/Treg失衡均与HBV病毒复制水平呈显著正相关。7.CHB患者经ETV抗病毒治疗48周后各项指标之间的相关性分析表明,外周血Th17细胞分别与RORytmRNA、Treg、IL-17和IL-23水平呈正相关,差异有统计学意义;但与ALT、AST、TBIL水平无明显相关关系(P>0.05)。CHB患者治疗后的Treg细胞与Foxp3mRNA、IL-10、TGFβ1水平呈正相关,差异有统计学意义,但与ALT、AST、TBIL水平无明显相关关系(P>0.05)。CHB患者治疗后的RORγtmRNA水平与Foxp3mRNA、IL-17、IL-23呈正相关性,差异有统计学意义;与ALT、AST、TBIL、Treg与Th17比值无相关性(P>0.05)。CHB患者治疗后的Foxp3mRNA与IL-10、TGFβ1、Treg与Th17比值呈正相关,差异有统计学意义,但与ALT、AST、TBIL无相关性(P>0.05)。CHB患者Treg与Th17比值与Foxp3mRNA有正相关性,差异有统计学意义;但与ALT、AST、RORytmRNA无明显相关(p>0.05)。CHB患者经过ETV抗病毒治疗48周后,随着HBV病毒复制的抑制和HBV DNA载量的显著不断下降,RORyt和Foxp3mRNA的高表达及Th17/Treg失衡程度获得逐渐的改善。[结论]1.慢性乙型病毒性肝炎患者外周血Th17和Treg细胞及其特异性转录因子RORyt和Foxp3 mRNA表达以及相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-10和TGFβ1水平均比健康对照组明显升高,提示CHB患者存在显著的Th17/Treg失衡。高病毒载量组CHB患者的Th17/Treg失衡明显重于低病毒载量组CHB患者。CHB患者RORyt和Foxp3 mRNA的高表达和Th17/Treg失衡的程度与HBV病毒复制水平的高低程度有关。2.CHB患者抗病毒治疗48周时,HBV DNA低于检测下线率、HBeAg转阴率、HBeAg血清学转换率及ALT复常率分别为81.6%,31.6%,13.2%及96.1%。经过ETV抗病毒治疗后HBV复制受到显著抑制,病毒复制水平显著下降,特异性转录因子RORyt和Foxp3 mRNA的高表达和其他相关免疫指标明显下降,Th17/Treg失衡可获得明显改善。3.病毒学应答组CHB患者基线Th17/Treg细胞及其特异性转录因子和相关细胞因子水平显著低于部分病毒学应答组,后者所存在的Th17/Treg失衡明显重于前者,且后者具有更高的基线HBVDNA载量水平。两组CHB患者抗病毒治疗48周后的病毒学、生化学和免疫学指标均获得显著改善。病毒学应答组CHB患者的RORyt和Foxp3mRNA高表达及Th17/Treg失衡状况的改善优于部分病毒学应答组CHB患者。4.CHB患者RORyt和Foxp3mRNA高表达与Th17/Treg失衡程度呈显著正相关。RORyt和Foxp3mRNA高表达及Th17/Treg失衡均与HBV病毒复制水平呈显著正相关。CHB患者经过ETV抗病毒治疗48周后,随着HBV病毒复制的抑制和HBV DNA载量的显著不断下降,RORyt和Foxp3mRNA的高表达及Th17/Treg失衡程度获得逐渐的改善。