论文部分内容阅读
研究背景与目的:脓毒症(sepsis)是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,同时是感染、烧/创伤、休克等急危重患者的严重并发症,病情凶险,发生率和病死率一直居高不下。目前临床上无特异性预防和治疗脓毒症的手段。其发生机制普遍认为是,系统性炎症反应和免疫抑制造成机体免疫平衡失调,炎性相关细胞因子分泌紊乱。因此,如能精细调控炎性细胞因子的产生,则能改善脓毒症的发生发展进程。巨噬细胞(macrophages,Mφ)在固有免疫和适应性免疫反应中,特别是在炎性细胞因子分泌中发挥主要作用,其功能紊乱在脓毒症的病理进程中扮演了重要角色。深入研究Mφ相关信号通路在脓毒症病理进程中的作用机制,并探寻新的调节策略,则可为脓毒症的防治提供新的手段。芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)是一种配体激活的转录因子,既往研究表明AhR在对环境中毒物和化学物质代谢,调节生物节律、生殖、氧化应激方面发挥作用。近年来发现其在固有和适应性免疫反应、自身免疫疾病以及感染和炎症方面具有重要功能。在免疫反应中,AhR不仅在T细胞、B细胞、单核细胞、中性粒细胞以及树突状细胞(dendritic cell,DC)功能调节方面扮演重要角色,而且还参与介导了炎症基因表达以及炎性Mφ的活性调节。研究证实,芳香烃受体对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的炎症反应和脓毒症的耐受诱导不可或缺,以AhR活化为特征的脓毒症小鼠可有效抵御革兰阳性菌、革兰阴性菌的致死性攻击。Mφ中由AhR活化驱动的促炎/抗炎平衡参与介导了宿主对脓毒症的易感/耐受状态。Mφ中活化的AhR参与介导了炎症基因表达及调控,AhR能下调促炎细胞因子白细胞介素 6(Interleukin-6,IL-6)和白细胞介素 1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达,但对于抗炎细胞因子如白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)的调控机制研究并不深入。在LPS刺激的AhR基因敲除(Knockout,KO)Mφ中,肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)、IL-6、IL-1β和 IL-18 的产生增多,但 IL-10 上升幅度减少。IL-10是一种多细胞源性的细胞因子,其中单核细胞、Mφ是其主要来源细胞。在控制病原体和微生物造成的炎症反应中,IL-10具有抗炎、免疫刺激/抑制、负反馈调节的生物学功能。在自然杀伤(natural killer,NK)细胞、骨髓来源树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDC)、T细胞等多种免疫细胞中,IL-10的表达可由不同的AhR信号通路介导,但在固有免疫的巨噬细胞中AhR调控IL-10的具体机制有待阐明。本研究拟以小鼠腹腔巨噬细胞为主要研究对象,结合骨髓和脾脏来源巨噬细胞,在AhR基因敲除小鼠的巨噬细胞和AhR过表达的RAW264.7细胞珠中,构建LPS诱导的体内外脓毒症模型,明确炎性巨噬细胞中AhR的表达规律及机制,探究AhR对IL-10表达的影响,阐明AhR调控IL-10表达的分子机制,调控AhR及IL-10的表达从而改善脓毒症小鼠的腹膜炎进程。实验方法:一、AhR对LPS刺激的巨噬细胞中IL-10表达的影响。1.提取小鼠腹腔、脾脏巨噬细胞并制备骨髓来源巨噬细胞,纯化和鉴定后进行体外培养,建立LPS体外刺激模型,采用免疫印迹(Western blot,WB)检测AhR蛋白水平的表达情况;2.取小鼠腹腔巨噬细胞,LPS体外刺激不同的时间,采用qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光的方法检测AhR mRNA和蛋白水平的表达情况;3.利用核转录因子(nuclear trancription factor κB,NF-κB)信号通路的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)预处理小鼠腹腔巨噬细胞后,再用LPS刺激,采用Western blot检测AhR蛋白水平的表达情况;4.将成年AhR+/-小鼠雌雄合笼交配,繁殖出AhR-/-小鼠,提取小鼠DNA并进行基因分型鉴定,构建AhR高表达的RAW264.7细胞株并进行鉴定;5.取WT和AhR KO小鼠的腹腔巨噬细胞和骨髓诱导的巨噬细胞,建立LPS体外刺激模型,采用Western blot检测AhR蛋白水平的表达情况,同时利用qRT-PCR和ELISA的方法检测IL-10 mRNA和细胞上清中蛋白水平的表达情况;6.取对照组的RAW/NC细胞和AhR高表达的RAW/AhR细胞,建立LPS体外刺激模型,采用qRT-PCR和Western blot的方法检测AhR mRNA和蛋白水平的表达情况,同时利用qRT-PCR和ELISA的方法检测IL-10 mRNA和细胞上清中蛋白水平的表达情况;7.在RAW/NC和RAW/AhR的巨噬细胞中,建立LPS体外炎症模型,采用qRT-PCR检测巨噬细胞中M1/M2表型标志物的情况。二、AhR调控LPS刺激的巨噬细胞中IL-10表达的分子机制。1.利用不同的AhR配体处理小鼠腹腔巨噬细胞后,再用LPS刺激,采用qRT-PCR和 ELISA 检测细胞色素 P4501A1(Cytochrome P4501A1,CYP1A1)mRNA 和细胞上清中IL-10蛋白水平的表达情况;2.预测IL-10基因启动子上的AhR结合位点并构建DNA探针,在RAW/NC和RAW/AhR的巨噬细胞中,建立LPS体外炎症模型,采用电泳迁移率改变试验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)方法检测核蛋白与 DNA 的结合活性;3.取对照组的293T/NC细胞和AhR高表达的293T/AhR细胞,将pGL3质粒和包含IL-10启动子区域质粒分别转染上述细胞,采用双萤光素酶报告基因系统检测IL-10启动子的报告基因活性;4.取对照组的RAW/NC细胞和AhR高表达的RAW/AhR细胞,建立LPS体外刺激模型,采用Western blot的方法检测STAT3、Src、mTOR和MAPK信号通路的变化情况;5.取对照组的RAW/NC细胞和AhR高表达的RAW/AhR细胞,采用IL-10中和抗体、STAT3和Src的小干扰RNA及抑制剂预处理细胞,再用LPS刺激后,采用Western blot检测STAT3、Src蛋白及磷酸化水平的表达情况,同时利用qRT-PCR和ELISA的方法检测IL-10 mRNA和细胞上清中蛋白水平的表达情况;6.取WT和AhR KO小鼠的腹腔巨噬细胞,建立LPS体外刺激模型,采用Western blot的方法检测STAT3、Src蛋白及磷酸化水平的表达情况。三、调控巨噬细胞中AhR及IL-10表达对小鼠腹膜炎的影响。1.分别取WT和AhR KO小鼠的腹腔巨噬细胞,AhR高表达腺病毒和对照腺病毒体外感染后,建立LPS刺激模型,采用流式细胞技术检测感染后细胞的绿色荧光强度,同时采用Western blot的方法检测AhR、p-Src和p-STAT3蛋白水平的表达情况;2.取WT捐献者小鼠的腹腔巨噬细胞,AhR高表达腺病毒和对照腺病毒体外感染后腹腔注射给WT接受者小鼠,建立LPS刺激的小鼠腹膜炎致炎模型,采用ELISA的方法检测腹腔灌洗液中IL-10、IL-6和IL-1β蛋白水平的表达情况;3.取WT捐献者小鼠的腹腔巨噬细胞,体外AhR高表达腺病毒和对照腺病毒感染后腹腔注射给WT接受者小鼠,建立LPS刺激的小鼠腹膜炎致死模型,观察并统计小鼠的生存情况。实验结果:一、AhR对LPS刺激的巨噬细胞中IL-10表达的影响。1.巨噬细胞的鉴定结果提示,小鼠腹腔和骨髓来源巨噬细胞比例为95%左右,脾脏巨噬细胞比例为30%左右。LPS能提高腹腔、脾脏和骨髓来源巨噬细胞中AhR蛋白的表达水平。2.LPS刺激腹腔巨噬细胞后,能够随时间依赖性地增强AhR mRNA和蛋白水平的表达。LPS刺激1 h后AhR的mRNA表达开始增加,在2 h达到峰值,随后开始下降,至12 h恢复到静息时的水平。LPS刺激2 h后AhR的蛋白表达开始增加而后持续至12 h,在8 h达到峰值。LPS刺激对AhR伴侣蛋白ARNT和HSP90的表达影响不明显。细胞免疫荧光结果也显示,LPS刺激6h和8h后AhR的蛋白表达增加。3.PDTC可抑制P65和P50蛋白入核,从而抑制NF-κB信号通路的激活,进而降低炎性巨噬细胞中AhR蛋白的表达水平。4.与WT小鼠相比,AhR KO小鼠的腹腔巨噬细胞和BMDM中AhR不表达。在LPS刺激的腹腔巨噬细胞和BMDM中,AhR敲除后减少IL-10 mRNA和蛋白水平的表达。5.RAW/AhR细胞相对于RAW/NC和正常RAW264.7细胞,AhR的mRNA和蛋白水平明显升高。在LPS刺激的RAW264.7细胞中,AhR高表达后增加IL-10 mRNA和蛋白水平的表达。6.在LPS诱导的AhR高表达巨噬细胞中,大部分M1型表面标志物的水平降低,M2型表面标志物IL-10的水平增高。二、AhR调控LPS刺激的巨噬细胞中IL-10表达的分子机制。1.AhR的激动剂和拮抗剂不影响炎性巨噬细胞中IL-10的表达。2.预测出IL-10启动子上AhR的结合位点,分别为-631至-607 bp的AhR1,-319至-343 bp的AhR2。在LPS刺激的RAW264.7细胞中,AhR不影响炎性巨噬细胞中IL-10启动子的DNA结合活性。3.AhR不影响IL-10启动子的DNA转录活性。4.在炎性巨噬细胞中,AhR高表达后可提高STAT3 Tyr705位点磷酸化水平,不影响STAT3蛋白含量和STAT3 Ser727位点磷酸化水平。STAT3的激活不依赖于IL-10自分泌环路。5.在炎性巨噬细胞中,AhR敲除后降低Src Tyr416和STAT3 Tyr705位点磷酸化水平,不影响Src和STAT3蛋白含量。6.AhR促进炎性巨噬细胞中IL-10的表达不依赖于mTOR信号通路和MAPK信号通路。7.在AhR过表达的RAW264.7细胞中,敲低Src和抑制Src Tyr416位点磷酸化后,不仅可降低STAT3 Tyr705位点的磷酸化水平,还可阻止LPS刺激下IL-10的表达。敲低STAT3和抑制STAT3 Tyr705位点磷酸化,虽不影响Src及Src磷酸化水平,但仍可阻止LPS刺激下IL-10的表达。三、调控巨噬细胞中AhR及IL-10表达对小鼠腹膜炎的影响。1.腺病毒感染的小鼠原代巨噬细胞中表达绿色荧光蛋白,细胞的FITC平均荧光强度增加。2.在AhR KO和WT的腹腔巨噬细胞中,通过腺病毒感染上调AhR的表达,不仅能提高LPS刺激下Src Tyr416位点和STAT3 Tyr705位点的磷酸化水平,还可以增加IL-10的表达。3.在LPS诱导的腹膜炎小鼠中,过继性转移AhR高表达的腹腔巨噬细胞后,能改善小鼠腹腔灌洗液中炎症因子水平,升高抗炎因子IL-10的水平,降低促炎因子IL-6和IL-1β的水平,提高腹膜炎小鼠的生存率。结论:一、LPS可通过激活巨噬细胞中NF-κB信号通路促进AhR表达。二、敲除AhR可致炎性巨噬细胞IL-10表达降低,而高表达AhR则可致IL-10表达增加,说明AhR正向调控LPS刺激的巨噬细胞中IL-10的生成。三、在炎性巨噬细胞中,AhR可以通过上调Src激酶的活性,提高Src Tyr416位点的磷酸化水平,进而激活STAT3,正向介导STAT3 Tyr705位点的磷酸化,从而促进IL-10的生成。四、在AhR KO和WT的炎性巨噬细胞中,上调AhR表达后能激活Src-STAT3信号通路,进而促进IL-10的表达。过继性转移AhR高表达的巨噬细胞,能降低腹膜炎小鼠的腹腔促炎因子水平,提高IL-10的水平,并降低其死亡率。