稻瘟病属于世界范围内的真菌性病害,严重威胁世界的粮食安全,由子囊菌亚门丝状真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染引起。水稻-稻瘟病菌的互作模式符合经典的“基因对基因”学说,通过筛选抗病基因和无毒基因的互作蛋白揭示各自参与的信号通路,有助于进一步阐明宿主与病原菌间的互作机制。Pik-H4由Pik₁-H4和Pik₂-H4组成,对广东的稻瘟病菌生理小种大多都表现出高抗。Pik₁-H4蛋白含有NBS-LRR结构域,Pik₂-H4蛋白含有NB-ARC结构域,该类结构域在植物的免疫系统中扮演重要角色。稻瘟病菌生理小种容易发生遗传变异,对抗病机制的诠释才能从根本上解决该问题。本研究主要通过瞬时表达系统利用免疫共沉淀技术筛选Pik-H4及Avr-Pik互作蛋白,结果如下:1、本研究中将水稻种子剥壳后种植在1/2 MS中8-10天左右,利用纤维素酶降解水稻叶鞘得到水稻的原生质体,将构建好的瞬时载体通过PEG介导转化到细胞中,能够在14-16 h左右得到目标蛋白的高效表达。通过实验发现,酶解的最佳时间为4-6h,转化的最佳时间为14-16 h,通过FAD染色发现,经暗培养后细胞还具有较高活力,通过BCA法测定蛋白的浓度可达到10 mg/ml,符合做免疫共沉淀的要求。2、通过将目标蛋白与GFP融合,转入到原生质体中,在激光共聚焦扫描显微镜下观察到Pik₁-H4主要定位在内质网,Pik₂-H4主要定位在质体,Avr-Pik主要定位在细胞膜。Avr-Pik蛋白被定位于水稻细胞膜上,推测该蛋白可能是先在细胞膜上积累进而通过某种形式运输到宿主细胞作为效应蛋白触发一系列反应。从定位结果初步推定Pik₁-H4可能主要参与Avr-Pik蛋白的识别反应以及信号传递的作用,Pik₂-H4主要起到改变能量的传输方式及调控下游抗病反应而引发过敏性坏死的作用。3、本实验利用免疫共沉淀的方法,通过MALDI-TOF胶条质谱测序初步筛选得到Pik₁-H4的互作蛋白4个,Pik₂-H4的互作蛋白6个,该结果都是互作较强的蛋白,表明Pik-H4和凝集素相关蛋白有较强的相互作用。通过QE溶液质谱测序初步筛选得到Pik₁-H4的互作蛋白45个,Pik₂-H4的互作蛋白57个,Avr-Pik的互作蛋白36个。4、通过DAVID在线数据库生物信息学分析发现,筛选到的互作蛋白主要分为四类:生物合成、能量转运、转录调控、膜相关蛋白。由结果可以初步推测,Pik-H4与无毒蛋白基因Avr-pik介导的抗病途径主要从次级代谢产物合成以及转录调控相关方面进行。本实验以质谱测序获得的蛋白进行GO聚类分析,在分子功能方面主要集中在催化特性,在生物学途径方面主要集中在代谢过程,在细胞学组件方面,筛选到的互作蛋白主要是参与细胞组成,在蛋白分类方面主要是与核酸结合及转运相关蛋白。GO聚类分析结果与DAVID数据库分析结果相似,大部分蛋白与能量转运及核酸结合相关。初步推测,筛选得到与转录因子相关蛋白、Pik₂-H4相关的能量转运蛋白及膜转运相关蛋白有较大的研究价值。