【摘 要】
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β-丙氨酸是一种重要的医药化工原料,在食品、医疗、环境等领域有广泛应用。L-天冬氨酸-α-脱羧酶（PanD）,可以特异性脱去L-天冬氨酸的α-羧基,将其转化为β-丙氨酸。为构建高产β-丙氨酸基因工程菌,本研究克隆了来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因（panD）,在E.coli BL21（DE3）中异源表达。并采用不同方法对基因工程菌进行优化,逐步提高了PanD的表达量,进而提高β-丙
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β-丙氨酸是一种重要的医药化工原料,在食品、医疗、环境等领域有广泛应用。L-天冬氨酸-α-脱羧酶（PanD）,可以特异性脱去L-天冬氨酸的α-羧基,将其转化为β-丙氨酸。为构建高产β-丙氨酸基因工程菌,本研究克隆了来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因（panD）,在E.coli BL21（DE3）中异源表达。并采用不同方法对基因工程菌进行优化,逐步提高了PanD的表达量,进而提高β-丙氨酸产量。分别选用p ET-22b（+）、p ET-29a（+）和p ET-30a（+）为表达载体,构建重组质粒p ET-22b（+）-panD、p ET-29a（+）-panD、p ET-30a（+）-panD,在E.coli BL21（DE3）中进行异源表达,成功构建三株产β-丙氨酸的基因工程菌E.coli BL21（DE3）/p ET-22b（+）-panD（简称22b）、E.coli BL21（DE3）/p ET-29a（+）-panD（简称29a）和E.coli BL21（DE3）/p ET-30a（+）-panD（简称30a）,均能表达有活性的PanD。综合比较PanD的表达量和催化效果,优选p ET-22b（+）和p ET-30a（+）作为进一步优化使用的表达载体。依据大肠杆菌的密码子偏好性,对目的基因序列进行优化,构建密码子优化菌株E.coli BL21（DE3）/p ET-22b（+）-panDo（简称22b-1）、E.coli BL21（DE3）/p ET-30a（+）-panDo（简称30a-1）。经密码子优化后,菌株22b-1的PanD表达量和催化效果未有提高,而菌株30a-1的PanD表达量和催化效果明显提高,β-丙氨酸产量可达79.77 mmol/L,约为优化前的2倍。采取自动诱导的策略对菌株30a-1性能进行进一步优化。结果表明,经自动诱导后,细胞数量大大增加,菌体浓度为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG）诱导菌浓的2.2倍。β-丙氨酸产量提高到140.82 mmol/L,较优化前提高了2.5倍,酶活可达20.57 U/m L发酵液。综上所述,通过分子生物学手段,构建含有不同表达载体的β-丙氨酸基因工程菌。采用不同方法对菌株性能进行优化后,菌株30a-1性能较好,具有一定的应用价值,也为工业化生产提供了一些参考。
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