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目的:哺乳动物的妊娠过程涉及到胚胎着床、胎盘形成、胚胎发育和分娩等多个环节,是一个极其精细且复杂的过程。胚胎着床后,位于系膜对侧胚胎周围的子宫内膜基质细胞进行增殖和分化,即蜕膜化（decidualization）。蜕膜细胞在子宫的横切面会形成两个明显的区域:围绕着胚胎的无血管的初级蜕膜区（primary decidualization zone,PDZ）和紧邻初级蜕膜区广泛分布血管的次级蜕膜区（secondary decidualization zone,SDZ）。基质细胞蜕膜化是胚胎着床过程中的关键环节。蜕膜化的机制目前依然尚未研究全面。高迁移率族蛋白B1（high motility group B1,Hmgb1）对于哺乳动物生命的存续是必须的。以往关于Hmgb1在妊娠中的作用研究集中在Hmgb1对囊胚发育的影响,Hmgb1在妊娠早期子宫中的作用及功能暂无研究。本课题组前期的表达谱测序发现Hmgb1在子宫内膜蜕膜化组织中表达上调。因此,本研究首先拟探讨Hmgb1与子宫内膜蜕膜化之间的关系。此外,Hmgb1在线粒体的质量控制（能量代谢系统、线粒体自噬以及线粒体融合/分裂）中发挥着重要的调控作用。而高能量驱动的线粒体活性在多倍体蜕膜细胞发育中发挥重要作用,以支持子宫内膜的分化和胚胎植入。线粒体功能异常导致的蜕膜细胞多倍化受损可能导致不孕。因此,本研究欲探讨的第二个问题,即Hmgb1在蜕膜化过程中是否调控线粒体质量控制。另外,Hmgb1在核内能够促进类固醇激素受体（ER/PR）等转录因子与靶DNA的结合,调控基因转录、表达及细胞分化等生命活动。雌激素受体（ERα和ERβ）和孕激素受体（PR-A和PR-B）在胚胎着床和蜕膜化中担负重要的角色。因此,本研究拟探讨第三个问题:核内Hmgb1是否转录调控ER/PR应答基因而影响蜕膜化过程。被释放到胞外的Hmgb1可与多种受体如RAGE,TLR4,TLR9等相互作用调控免疫过程。蜕膜化过程中会有多种免疫细胞的参与。因此,本文拟探讨的第四个问题:释放到胞外的Hmgb1是否会调控免疫从而影响蜕膜化过程。本文研究了Hmgb1在围着床期的表达规律及其调控小鼠蜕膜化过程的分子机制,以全面了解Hmgb1在围着床期的作用,为蜕膜化的研究提供新的有力证据。方法:1.建立动物孕期模型:小鼠正常妊娠模型:8周龄性成熟昆明雌鼠（体重28-30g）与性成熟雄鼠合笼交配,次日早晨检查阴栓,见阴栓记为孕第一天（D1）。取小鼠妊娠D1,D4,D5,D6,D8子宫内膜组织材料（8只/天）。小鼠假孕模型:8周龄性成熟昆明雌鼠与结扎输精管雄鼠合笼交配,次日早晨检查阴栓,见阴栓记为假孕第一天（PD1）。取小鼠假孕PD1,PD4,PD5,PD6,PD8子宫内膜材料（8只/天）。小鼠延迟着床模型:妊娠D3小鼠晚上被切除双侧卵巢。在妊娠D4-D7早晨给予切除卵巢的小鼠皮下注射孕酮100μl（1mg/0.1ml玉米油）。妊娠D7天将小鼠分为两组:一组继续皮下注射孕酮100μl（1mg/0.1ml玉米油）,记为延迟着床组（5只/组）。另一组皮下注射孕酮100μl（1mg/0.1ml玉米油）和雌二醇100μl（25ng/0.1mL玉米油）,记为延迟着床激活组（5只/组）。D8脱颈处死小鼠,延迟组用生理盐水冲洗子宫后检测是否有延迟着床的胚胎,激活组尾静脉注射1%台盼蓝溶液,检测是否有着床的胚胎。人工诱导蜕膜化模型:8周龄性成熟昆明雌鼠与结扎输精管雄鼠合笼交配,次日早晨检查阴栓,见阴栓记为假孕第一天（PD1）。PD4清晨小鼠子宫一侧宫角注射玉米油5μl,对侧子宫注射等量PBS作为对照（8只/组）。至PD8早晨取子宫内膜材料。宫角注射:小鼠于假孕第四天（PD4）上午进行宫角注射Hmgb1抑制剂甘草酸,双侧子宫角一侧注射5μl甘草酸（glycyrrhizia acid,GA）+玉米油（Oil）混合液（5mM）,对侧宫角注射5μl玉米油（含等量甘草酸溶剂DMSO）,于PD8收集子宫内膜材料（5只/组）。另外5只PD4小鼠,一侧宫角注射5μl玉米油（含甘草酸溶剂DMSO）,对侧宫角注射等量DMSO,PD8收集子宫材料（5只/组）。另外5只PD4小鼠一侧子宫角注射5μl PBS作为对照,对侧子宫角注射等量DMSO,于PD8收集子宫材料（5只/组）。2.细胞体外诱导蜕膜化模型:原代子宫内膜基质细胞培养液中加入最终浓度为10nM雌二醇（E2）与1μM孕酮（P4）诱导72h,对照组加入溶剂无水乙醇作为对照。3.Hmgb1的表达与蜕膜化的关系:（1）子宫内膜蜕膜化检测:观察围着床期小鼠蜕膜化时期（D5-D8）子宫外观。人工诱导蜕膜化后,对子宫称重,RT-qPCR检测蜕膜化标识分子dtprp的mRNA水平,以验证人工诱导蜕膜化是否成功。体外功能实验,诱导蜕膜化利用雌孕激素诱导小鼠原代子宫内膜基质细胞,采用RT-qPCR检测dtprp的mRNA水平。（2）Hmgb1在围着床期的表达:免疫组化（IHC）、原位杂交（ISH）、Western Blot、RT-qPCR检测在D1、D4、D5IS（着床点）、D5IIS（着床旁）、D6IS、D6IIS、D8IS天Hmgb1的表达情况;（3）Hmgb1在假孕期的表达:IHC、Western Blot、RT-qPCR检测在PD1、PD4、PD5、PD6、PD8天Hmgb1的表达情况;（4）Hmgb1在延迟着床模型的表达:IHC检测在延迟着床组与激活组Hmgb1的表达;（5）Hmgb1在人工诱导蜕膜化模型的表达:IHC、Western Blot、RT-qPCR检测在人工诱导蜕膜化组织（ID）以及对照组织（Vehicle）中Hmgb1的表达情况;（6）Hmgb1在原代子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型中的表达:免疫荧光鉴定原代细胞纯度;RT-qPCR检测dtprp的表达以鉴定诱导蜕膜化是否成功;检测诱导诱导蜕膜化组以及siRNA敲低Hmgb1组dtprp,hmgb1的mRNA水平。4.宫角注射Hmgb1抑制剂甘草酸,检测蜕膜化情况:观察宫角注射后小鼠子宫外观,统计子宫湿重。5.线粒体质量控制检测方法:（1）采用激光共聚焦检测线粒体形态,比较敲低Hmgb1的表达对线粒体形态学影响。细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。Mitotracker Red染色细胞线粒体,通过激光共聚焦观察线粒体碎片化程度。统计各组碎片化程度。（2）采用流式细胞术检测线粒体膜电位,评估敲低Hmgb1对线粒体功能的影响。细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。JC-1染色细胞,流式细胞仪检测红、绿荧光强度,用红/绿比值评估线粒体膜电位是否发生变化。（3）采用酶标仪检测ATP生成,评估敲低Hmgb1对线粒体功能的影响:细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。采用酶标仪检测ATP生成量。（4）采用流式细胞术检测活性氧（ROS）生成状况,评估敲低Hmgb1对线粒体功能的影响。细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。DCFH-DA探针染色细胞,流式细胞仪检测活性氧强度。6.细胞自噬的检测:（1）体内诱导蜕膜化模型,Western Blot检测各处理组线粒体相关因子及自噬相关因子的表达;（2）体外细胞实验,敲低Hmgb1后诱导蜕膜化,Western Blot、RT-qPCR检测各处理组线粒体相关因子及自噬相关因子的表达;（3）宫角注射甘草酸与玉米油模型,Western Blot、RT-qPCR检测各处理组线粒体相关因子及自噬相关因子的表达;透射电镜检测自噬小体。7.RNA-seq检测在蜕膜化过程中受Hmgb1调控的差异基因采用转录组测序法对宫角注射的正常组（PBS）-A1组、诱导蜕膜化组（Oil+DMSO）-A2组、溶剂对照组（DMSO）-A3组、抑制组（GA+Oil+DMSO）-A4组的子宫组织材料进行转录组测序,分析差异表达基因,对差异基因进行功能聚类（GO分析）。8.RNA-seq测序数据分析:（1）分析在蜕膜化过程中受Hmgb1调控与线粒体功能相关的差异基因;（2）分析在蜕膜化过程中受Hmgb1调控与ER/PR应答基因相关的差异基因;（3）分析在蜕膜化过程中受Hmgb1调控与免疫相关的差异基因。结果:1.Hmgb1对蜕膜化的影响:（1）Hmgb1在围着床期的表达规律:IHC结果显示:Hmgb1仅表达于D1腔上皮与腺上皮;D4天Hmgb1表达于腔上皮、腺上皮以及部分基质细胞中;Hmgb1高表达于D5IS初级蜕膜区以及D6IS、D8IS的次级蜕膜区,在D5IIS与D6IIS仅表达于腔、腺上皮。ISH结果显示:同IHC结果一致,Hmgb1于D1仅表达于腔上皮与腺上皮,D4表达于腔、腺上皮与部分基质细胞;Hmgb1在D5IS、D6IS、D8IS蜕膜区域高表达,D5IIS与D6IIS仅在腔上皮与腺上皮表达。Western Blot与RT-qPCR结果显示Hmgb1在着床点高表达。（2）Hmgb1在假孕期的表达规律:IHC结果显示:Hmgb1在PD1、PD4、PD5、PD6、PD8腔上皮与腺上皮表达,且PD5、PD6、PD8呈弱表达。Western Blot与RT-qPCR结果显示Hmgb1在PD5、PD6、PD8弱表达。（3）Hmgb1在延迟着床模型的表达规律:IHC结果显示,Hmgb1低表达于延迟组,高表达于激活组。（4）Hmgb1在诱导蜕膜化模型的表达:诱导蜕膜化组经dtprp鉴定为诱导蜕膜化成功模型,Hmgb1在诱导蜕膜化组呈强阳性表达。（5）抑制Hmgb1对体内蜕膜化的影响:宫角注射获取人工诱导蜕膜化组（Oil）、GA+Oil组、PBS组以及溶剂DMSO组,结果显示,与诱导蜕膜化组相比,GA+Oil组蜕膜化受到抑制。（6）敲低Hmgb1对体外诱导蜕膜化的影响:在原代子宫内膜基质细胞中加入siRNA敲低Hmgb1后诱导蜕膜化发现:Hmgb1敲低后蜕膜化标志物dtprp表达下降,表明敲低Hmgb1会阻碍蜕膜化进程;细胞仅诱导蜕膜化后Hmgb1表达升高。2.Hmgb1调控线粒体质量而影响蜕膜化进程:（1）Mitotracker Red染色细胞线粒体,采用激光共聚焦观察线粒体碎片化程度发现,与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组线粒体碎片化程度增高,影响线粒体形态结构;（2）流式检测线粒体膜电位发现:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组线粒体膜电位降低,影响线粒体发挥正常功能;（3）酶标仪检测ATP生成发现:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组ATP生成减少,影响线粒体发挥正常功能;（4）流式细胞检测ROS生成发现:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组活性氧释放增多,影响线粒体发挥正常功能。4.Hmgb1调控细胞自噬过程进行线粒体质量控制,从而影响蜕膜化进程:（1）体内诱导蜕膜化模型,采用Western Blot检测发现,诱导组线粒体相关因子Drp1、Slp2表达上调,自噬相关因子Lc3b-Ⅱ表达上调;（2）体外细胞实验:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组,Western Blot检测线粒体相关因子Slp2表达降低,自噬相关因子Lc3b-Ⅱ表达降低;RT-qPCR检测线粒体相关因子slp2,dnm1l降低,自噬相关因子map1lc3b,atg5表达下降,sqstm1表达升高;（3）宫角注射玉米油人工诱导蜕膜化组（Oil）、注射GA+Oil组、注射PBS组以及注射溶剂DMSO组:Western Blot检测线粒体相关因子Slp2,GA+Oil组较诱导组（Oil）蛋白水平表达下降,自噬相关因子Lc3b-Ⅱ表达下降,p62表达升高;RT-qPCR检测线粒体相关因子slp2表达降低,自噬相关因子map1lc3b,atg5表达下降,sqstm1表达升高。（4）在诱导组（Oil）可观察到自噬小体,GA+Oil组可看到空泡化线粒体存在。5.对玉米油宫角注射人工诱导蜕膜化Oil（A2）、GA+Oil（A4）、注射PBS（A1）以及注射溶剂DMSO（A3）的子宫组织进行RNA-seq测序,结果共获得在蜕膜化过程中与Hmgb1相关的差异基因1505个,其中与线粒体功能和自噬相关的差异基因有32个;与转录调控ER/PR应答基因的差异基因有27个;与调控免疫相关的差异基因有19个。结论:1.Hmgb1在围着床期具有特定的时空表达特点,在胚胎着床过程中与蜕膜化相关;缺乏Hmgb1会抑制小鼠子宫内膜基质细胞的蜕膜化进程,从而影响妊娠结局。2.在蜕膜化过程中,Hmgb1通过调控胞质中线粒体自噬而进行线粒体质量控制;缺失Hmgb1则无法正常调控细胞自噬而造成线粒体损伤,线粒体无法发挥正常功能最终造成蜕膜化进程受阻。3.在蜕膜化过程中,核内Hmgb1通过调控ER/PR应答和免疫应答过程相关基因从而发挥调控细胞增殖与分化功能。