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目的:肝细胞癌是全球第三大致死性癌症,其发病率高,预后较差,目前仍缺乏有效的治疗效果。寻找有效的肝细胞癌治疗和辅助治疗药物有重要的意义。17β-羟类固醇脱氢酶(17β-Hydroxysteroid dehydrogenase,HSD17B4)催化雌二醇(E2)脱氢失活,生成雌酮(E1),是一种重要的激素代谢酶。我们近期的研究发现,人肝癌组织中HSD17B4高表达,肝癌细胞HepG2中高表达的HSD17B4降低E2水平后,使信号途径中的蛋白激酶(Akt)和丝裂原信号调节激酶MEK/ERK激活,进而使STAT3磷酸化激活,上调cyclin D1和PCNA等基因的表达,最终促进肝癌细胞的增殖。维生素K(VK)是一种脂溶性维生素。VK除了凝血作用外,还有抗包括肝癌在内的多种肿瘤的作用。VK2的类似物,对肝癌的发展有一定的抑制作用,对介入和手术治疗后的复发也有较好的疗效。最近的,一篇报道显示,VK2可与HepG2细胞内的HSD17B4相结合而影响其活性。综合以上我们的前期工作以及文献报道的实验结果,我们的考虑:VK2是否也可能通过与HSD17B4相互作用,降低其活性,上调雌激素(E2)水平,来发挥其抑制肝癌细胞的增殖的作用?为了验证上述假设,(1)本实验用VK2处理HSD17B4过表达的HepG2细胞后,观察其在裸鼠皮下成瘤的瘤体大小;(2)观察VK2处理HepG2后,细胞的增殖、激素水平变化、VK2与HSD17B4的相互作用,以及其相关信号通路关键分子的活性改变,探讨VK2对HSD17B4过表达引起的肝癌细胞增殖的抑制作用,为VK2作为预防和治疗肝癌的辅助分子提供理论和实验依据。方法:1 细胞培养常规培养人类肝癌细胞株HepG2细胞。2 细胞处理给HepG2细胞转染过表达HSD17B4的表达质粒和对照的空质粒并给予VK2处理;或给HepG2细胞转入敲低HSD17B4的siRNA和对照的siRNA,并给予VK2处理。3 裸鼠HepG2皮下成瘤实验在裸鼠皮下注射上述过表达或敲低HSD17B4并VK2处理后的HepG2细胞,成瘤6周,观察瘤体大小。4 MTS检测细胞增殖检测VK2对HSD17B4引起的HCC细胞增殖的抑制作用。5 RT-real time PCR检测HSD17B4 m RNA表达水平实时定量PCR检测VK2对HSD17B4转录水平的影响。6 Western blot检测目的基因蛋白表达水平Western blot测定VK2对HSD17B4、cyclin D1、PCNA、p-STAT3、p-Akt、p-MEK和p-ERK的蛋白水平表达的影响。7 放射免疫分析检测E2的改变用相同时间内底物E2的减少量反映HSD17B4的催化活性。观察VK2对HSD17B4的活性影响。8 ELISA实验检测VK2的量用抗体沉淀HSD17B4蛋白,测定沉淀中的VK2量,以证明VK2是否与HSD17B4相互作用9 数据处理采用SPSS17.0统计学软件进行处理分析。数据以x±SD表示,多组样本之间两两比较用多个均数比较的方差分析,以p<0.05为差异有统计学意义。结果:1 Vitamin K2能够抑制HSD17B4促裸鼠肝细胞癌的生长1)VK2能够抑制HSD17B4上调的裸鼠皮下HepG2肿瘤的生长与Empty(1311±108.6)相比,HSD17B4(7295±1135)组的瘤体较大;两组分别给予VK2处理后(Empty+VK2(421.2±112.7)组/HSD17B4+VK2(2835±682.8)组),瘤体分别较VK2未处理组的小。VK2对对照组和HSD17B4过表达组的瘤体生长抑制率相同,约为65%。表明,VK2有抑制HSD17B4促裸鼠肝肿瘤生长的作用。2)Vitamin K2能够抑制HSD17B4上调HepG2肝癌细胞的增殖与对照组相比,HSD17B4过表达组的HepG2细胞增殖上调,当分别给予VK2处理后,细胞的增殖呈时间和浓度依赖性地降低;用siRNA敲低了HSD17B4的表达后,细胞的增殖明显降低,此时,VK2的处理对细胞的增殖影响不大。表明,VK2能抑制HSD17B4促肝癌细胞的增殖。2 Vitamin K2能与HSD17B4相互作用而降低肝癌细胞的HSD17B4活性1)VK2能抑制HSD17B4的活性HSD17B4可催化雌二醇(E2)转化为雌酮,所以本实验用相同条件下E2的水平反映HSD17B4的活性。用不同浓度的VK2(0,20,50,100μmol/L)处理对照组和过表达HSD17B4组的HepG2细胞48 h后,检测培养基中E2的水平。结果显示,随着VK2剂量的增加,培养基中E2水平也随之增加。表明,VK2抑制了HepG2细胞的HSD17B4的活性。2)VK2对HSD17B4的m RNA和蛋白表达无影响用VK2分别处理对照组和过表达HSD17B4组的HepG2细胞后,细胞HSD17B4的m RNA表达和蛋白水平均无明显变化。同样,VK2对HSD17B4敲低(Si HSD17B4组)和其对照组(Si NC组)的HepG2细胞的处理,也不影响细胞的HSD17B4 m RNA水平以及蛋白水平。表明,VK2不是通过抑制HSD17B4的m RNA和蛋白表达而抑制其活性的。3)VK2能与HSD17B4相互作用而改变HSD17B4活性给予对照组(Empty)和过表达HSD17B4组的HepG2细胞不同浓度的VK2(0,10,20,50,100μmol/L)处理48 h,用抗HSD17B4抗体沉淀细胞的HSD17B4,用ELISA法检测沉淀中VK2的含量,以证明VK2是否与HSD17B4结合。ELISA结果显示,随着VK2剂量的增加,Empty组的沉淀中VK2含量不随VK2的处理浓度变化而变化,但HSD17B4过表达组的沉淀中VK2含量随VK2的浓度增加。表明,VK2可与HSD17B4相互作用。3 Vitamin K2能够抑制HSD17B4上调肝癌细胞中增殖相关蛋白的表达Western blot的结果显示,给予对照组(Empty)和过表达HSD17B4组HepG2细胞VK2(50μmol/L)处理48 h后,细胞增殖相关基因cyclin D1和PCNA的蛋白水平均有所降低。而VK2对敲低HSD17B4(Si HSD17B4)组和其对照组(Si NC)的cyclin D1和PCNA蛋白水平几乎无影响。表明,VK2能抑制了HSD17B4上调的细胞增殖相关基因的蛋白表达。4 Vitamin K2能够抑制HSD17B4上调肝癌细胞Akt和MEK/ERK信号通路以及STAT3的活化1)VK2能够抑制HSD17B4上调的STAT3的活化Western blot的结果显示,用VK2(50μmol/L)处理过表达和敲低HSD17B4的HepG2细胞48 h后,VK2显著降低了过表达HSD17B4组细胞的STAT3的磷酸化水平;而对敲低HSD17B4组细胞的STAT3的磷酸化水平影响不大。表明,VK2能够抑制HSD17B4上调的STAT3的活化。2)VK2能够抑制HSD17B4上调的Akt和MEK/ERK信号通路活性由于Akt,ERK,MEK激酶信号途径都与增殖相关,并能够激活STAT3,因此,我们用VK2处理过表达和敲低HSD17B4的HepG2细胞后,检测了这些激酶的活化程度,以证明它们是否与上述的STAT3的激活抑制有关。Western blot的结果显示,VK2显著降低了HSD17B4过表达组细胞的Akt,ERK,MEK的磷酸化水平,而对敲低HSD17B4组细胞的Akt,ERK,MEK的磷酸化水平影响不大。表明,VK2能够抑制HSD17B4上调的Akt,ERK,MEK的激活,与其抑制STAT3的活化有关。结论:Vitamin K2通过抑制HSD17B4的活性而发挥抑制肝癌细胞的生长的作用。其机制如下:(1)Vitamin K2通过与HSD17B4相互作用,降低HSD17B4的活性,增加了细胞E2的水平。(2)增加的E2抑制了Akt和MEK/ERK信号通路的激活,进而抑制了STAT3活化。(3)STAT3活性的降低,下调了cyclin D1和PCNA等生长相关基因的表达,最终导致肝癌细胞的增殖抑制。