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目的 探讨外源性C8-神经酰胺对小鼠肺泡上皮屏障功能的影响,包括肺泡II型上皮细胞(AEC II)单层通透性和紧密连接蛋白的改变,以及C8-神经酰胺诱导AEC II凋亡的作用。方法 将孕18天的ICR小鼠剖杀,取出胎鼠肺组织,经胰蛋白酶消化法分离出AECII,并运用差速贴壁法进行纯化;应用碱性磷酸酶染色法和电镜对得到的AECII进行鉴定;于Transwell构建单层AECII,待细胞融合后给予不同浓度的C8-神经酰胺(0、25、50、100μmol/L)继续培养24 h,应用伏欧计测定跨上皮电阻值(TEER)并用辣根过氧化物酶(HRP)标记法检测吸光度值(OD470);分别提取AECII的细胞总蛋白,采用Western blot法检测不同浓度的C8-神经酰胺对AECII紧密连接蛋白(ZO-1,Occludin,Claudin-4)蛋白水平的影响;提取AECII的细胞总RNA,采用实时定量聚合酶链式反应方法检测不同浓度的C8-神经酰胺对AECII紧密连接蛋白(ZO-1,Occludin,Claudin-4)m RNA水平的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组AECII的凋亡率。结果 细胞鉴定结果证明,本次实验提取的细胞为胎鼠肺泡II型上皮细胞,具有肺泡II型上皮细胞的特征性结构。随着C8-神经酰胺浓度的增加,TER值逐渐下降,各组间TER值差异有统计学意义(F=38.780,P<0.001)。不同浓度组与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。HRP测定结果显示,随着浓度的增加,OD470呈上升趋势,各组间OD470差异有统计学意义(F=19.780,P<0.001),神经酰胺50μmol/L组和100μmol/L组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。C8-神经酰胺100μmol/L剂量组与对照组相比,ZO-1的表达显著下调(P<0.05),与25μmol/L剂量组相比,ZO-1的表达亦显著下调(P<0.05);各剂量组Occludin的表达差异有统计学意义(F=7.703,P=0.002);神经酰胺100μmol/L组与对照组和25μmol/L剂量组相比,Occludin的表达均下调;各剂量组Claudin-4的蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。C8-神经酰胺各剂量组Claudin-4 m RNA水平差异无统计学意义(P>0.05);各组间ZO-1及Occludin m RNA表达水平的差异均有统计学意义(ZO-1:F=4.887,P=0.014;Occludin:F=3.637,P=0.048);C8-神经酰胺100μmol/L组与对照组相比,ZO-1及Occludin m RNA表达水平的差异有统计学意义(P<0.05)。同时神经酰胺各剂量组与对照组相比,细胞凋亡率的差异均有统计学意义(均P<0.01);不同剂量组间细胞凋亡率的差异仍有统计学意义(均P<0.05)结论 C8-神经酰胺可能通过下调紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)的表达增加AEC II单层细胞的通透性,同时诱导AEC II细胞凋亡进一步破坏肺泡上皮屏障,为进一步研究神经酰胺引起肺上皮屏障功能受损的分子机制提供了基础,同时为ALI提供新的诊断思路及治疗靶点。