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目的:通过观察清肠化湿方对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的实验性结肠炎小鼠脾脏及结肠组织中Th17/Treg细胞平衡的影响,初步探讨清肠化湿方治疗溃疡性结肠炎(UC)的作用机制。 方法:体外实验:予刀豆蛋白A(ConA)刺激小鼠脾淋巴细胞体外分化,并与相应药物共培养48h。分为空白对照组、模型对照组、清肠化湿方组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组。流式细胞术(FACS)检测各组CD4+IL-17+、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T细胞的比例;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测脾淋巴细胞中RORγt、Foxp3蛋白的表达。体内实验:将32只SPF级雌性Balb/C小鼠,随机分为空白组、模型组、清肠化湿方组、SASP组,治疗7d后处死,无菌取脾并留取新鲜结肠标本。观察结肠黏膜大体形态及组织学改变;免疫组化SP法观察结肠组织中IL-17、Foxp3的浸润情况;FACS检测小鼠脾淋巴细胞中CD4+IL-17+、CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T细胞的比例;实时荧光定量PCR(real-time PCR)法检测结肠组织中RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的表达水平;Western Blot法检测RORγt、Foxp3蛋白的表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测结肠组织上清液中促炎细胞因子IL-17、IL-23及抑炎细胞因子TGF-β的水平;采用相关性分析探讨Th17与Treg细胞,Th17/Treg比值与病理组织学评分,转录因子RORγt与Foxp3,以及细胞因子之间的相关性。 结果:体外实验:模型组脾淋巴细胞中CD4+IL-17+/CD4+T较空白组升高(P<0.05),CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T较空白组降低(P<0.05),RORγt蛋白较空白组明显升高(P<0.01),Foxp3蛋白水平较空白组明显降低(P<0.01);经清肠化湿方干预后,CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T较模型组明显升高(P<0.01),ROR蛋白表达较模型组降低(P<0.05),Foxp3蛋白较模型组显著升高(P<0.001);相关性分析示RORγt与Foxp3蛋白水平呈负相关(R=-0.43,P<0.05)。体内实验:模型组结肠黏膜病理组织学评分较空白组显著增加(P<0.001),小鼠脾脏中CD4+IL-17+/CD4+T较空白组明显升高(P<0.01),而CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T比例降低(P<0.05),结肠组织中IL-17浸润较空白组明显增加,而Foxp3浸润明显减少(P<0.01),RORγt基因及蛋白水平均较空白组显著升高(P<0.001),而Foxp3基因及蛋白水平均显著降低(P<0.001),促炎因子IL-17、IL-23水平均较空白组显著增高(P<0.001),而抑炎因子TGF-β水平降低(P<0.05);经清肠化湿方治疗后,病理组织学评分明显好转(P<0.01),脾脏中CD4+IL-17+/CD4+T较模型组显著降低(P<0.001),而CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T比例升高(P<0.05),结肠组织中IL-17浸润明显低于模型组(P<0.01),而Foxp3浸润增加(P<0.05),RORγt基因及蛋白水平均较模型组降低(P<0.01,P<0.001),且与SASP组相比差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),两Foxp3基因及蛋白水平均较模型组升高(P<0.001,P<0.01),促炎因子IL-17、IL-23水平均明显降低(P<0.01)。相关性分析示,脾脏中Th17与Treg细胞水平呈显著负相关(R=-0.80,P<0.01),Th17/Treg比值与病理组织学评分呈明显正相关(R=0.72,P<0.01);结肠组织中RORt与Foxp3基因水平呈显著负相关(R=-0.78,P<0.01),蛋白水平呈负相关(R=-0.33,P<0.05);细胞因子IL-17与IL-23水平呈显著正相关(R=0.60,P<0.01),而与TGF-β呈负相关(R=-0.55,P<0.05)。 结论:清肠化湿方可以改善实验性结肠炎小鼠的一般情况和结肠炎症,其机制可能为通过降低转录因子RORγt基因及蛋白的表达,减少Th17细胞生成,并抑制促炎细胞因子IL-17等分泌;同时上调Foxp3基因及蛋白的表达,促进Treg细胞生成并释放抑炎细胞因子TGF-β,维持免疫耐受。Th17/Treg细胞平衡是维持肠道免疫稳态的关键因素。