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龟类的人工繁殖被国际龟类保护组织(IUCN/SSC,TFTSG和TCF)列为目前挽救龟类惨遭灭绝的最急迫也是最有效的方法之一,但龟类中大多数种类的人工繁殖问题仍未得到解决。通过营养学途径改善龟类亲体的繁殖性能,提高性腺发育质量和产卵量为解决龟类的人工繁殖问题提供了可能的途径。目前生殖营养学的理论研究在鱼类和虾类中开展的较多,但在龟类中相关研究几乎处于空白。PUFAs是卵黄蛋白原(VTG)和胚胎细胞生物膜的重要成分之一,显著影响动物的生殖性能(性腺发育、产卵力、卵的质量等),是其生命过程中不可缺少的营养因子之一。但迄今为止,国内外关于PUFAs对龟类卵巢发育的影响及机理研究鲜有报道。通过研究龟类的脂质代谢与卵黄发生的关系,以便在不同的卵黄发生期为中华条颈龟提供合适的脂质营养,为解决人工养殖条件下龟类的性腺发育和繁殖的问题奠定前期基础,现选取雌性成体中华条颈龟(四龄,体重1557±307 g)驯养于海南师范大学养殖室。两周后,开始正式试验,按日粮中豆油和鱼油的添加比例不同随机分成4组,分别命名为3S∶0F组(豆油∶鱼油,3∶0)、2S∶1F组(豆油∶鱼油,2∶1)、1S∶2F组(豆油∶鱼油,1∶2)和0S∶3F组(豆油∶鱼油,0∶3)。每周喂食两次,为期一年;每两个月从每组中随机选取6只,低温冷冻麻醉后解剖,取血液测量卵黄蛋白原(VTG)含量、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC);取肝脏测量脂肪酸组成、肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)基因表达量、肝脂酶(HL)活力、脂蛋白脂酶(LPL)活力、脂肪酸合成酶(FAS)活力和激素敏感性脂肪酶(HSL)活力;取肌肉测量脂肪酸组成;取十二指肠测量胰脂肪酶(PL)活性和十二指肠组织结构。研究结果如下:1.通过测定不同卵黄发生期血清VTG含量,研究日粮PUFAs对中华条颈龟卵黄募集的影响。VTG含量在不同卵黄发生期与处理间的交互效应显著(F=1.969,df=25,P=0.019<0.05)。卵黄发生前期,日粮PUFAs对VTG含量影响不显著(P>0.05)。卵黄发生中后期,PUFAs尤其是n-3 PUFAs提升血清VTG含量效果显著(P<0.05),中期的0S∶3F组的VTG含量均在3S∶0F组的2倍以上;而后期0S∶3F组的VTG含量都在混合油组的1.5倍以上,甚至达到了3S∶0F组的3倍左右(P<0.05)。在产卵期,VTG含量总体明显下降,0S∶3F组均在3S∶0F组的3倍以上(P<0.05)。综上所述,卵黄发生中后期以外源性卵黄合成为主,受日粮PUFAs影响较大,日粮中不饱和脂肪酸含量越高,血清中VTG含量亦高。2.为了揭示pufas影响卵黄募集的途径和机理,本研究进一步探讨了日粮pufas对不同卵黄发生期中华条颈龟脂质代谢的影响:(1)对脂质吸收过程的影响卵黄发生前期,胰脂肪酶(pl)活力较低,此时外源脂质吸收较少;中期,pl活力明显上升,峰值出现在11月份,几乎是卵黄发生前期3倍以上,外源脂质的吸收在中期达到高峰;而后期pl的活力整体降至最低,且各处理组之间的pl活力差异不显著(p>0.05),这与限制脂质过量摄入有关;产卵期,pl活力又逐渐升高,这是对脂质消耗的补充作用。不同卵黄发生期,3s∶0f组和1s∶2f组pl活力均高于其余组,且3s∶0f组pl活力在卵黄发生前期、中期和产卵期均为0s∶3f组2.2倍以上,其中前期甚至达到了0s∶3f组4.4倍(p<0.01),说明n-3pufas对pl具有显著的抑制作用。通过观察肠道组织结构发现,3s∶0f组肠绒毛长度变短,仅为其余处理组的7/9左右(p<0.05),1s∶2f组绒毛长/隐窝深(v/c)几乎是3s∶0f组1.4倍(p<0.05),说明pufas可以通过提高十二指肠绒毛长度和v/c值,来提高十二指肠上皮细胞的成熟度,从而增强脂质的吸收能力。(2)对脂质转运过程的影响脂质被吸收进入到血液之后,被相应的脂肪分解酶分解,在转运载体蛋白的作用下,被转运至不同的组织,从而影响血脂水平。在卵黄发生前期,肝脏中的hl和lpl的活力到达峰值,hl和lpl的活力与日粮中n-6pufas含量的变化呈正相关,最大活力均出现在2s∶1f组。hl活力在2s∶1f组几乎是0s∶3f组的3倍(p<0.05),而lpl最大活力组几乎是0s∶3f组的4倍(p<0.01),说明n-3pufas具有抑制hl和lpl活力的作用。此时hsl的活力降至最低,0s∶3f组的hsl活力显著高于其余组,几乎达到3s∶0f组的1.4倍(p<0.05),说明pufas具有提升hsl活力的作用。综合上述分解酶活力的变化,说明前期主要以内源性的脂质动员为主。血清中hdl-c水平在前期降至最低,而ldl-c则升至峰值,大量的脂质在前期从肝脏等部位被转运到卵巢,最终造成血清血脂水平的下降(特别是tg,下降到最低)。但pufas对hdl-c,ldl-c和tg的影响均不显著,0s∶3f组的tc含量显著低于3s∶0f组和1s∶2f组(p<0.05)。n-3pufas会促使tc通过粪固醇等途径排出体外,同时减少tc合成以应对机体对tg需求的减少。在卵黄发生中后期,hl和lpl的活力均保持在前期的2/3左右,其中中期的9月份hl和lpl的活力不到前期的1/2,hsl的活力达到峰值,这标志着外源脂质分解增强,内源脂质分解减弱。hl和lpl在中期的9月份和后期受日粮影响显著,而hsl在整个中后期均显著受到日粮的影响,说明中后期外源性的脂质摄入是机体的主要脂质营养来源。hdl-c含量逐渐升高,并在后期达到峰值,但受日粮的影响不显著(p>0.05)。ldl-c的含量在中期的9月份降至最低,不到前期的1/6。中期的9月份,日粮pufas显著提高了l-fabp的表达量,其中0s∶3f组均在其余组的2倍以上(p<0.05)。日粮的pufas通过直接抑制ldl-c对脂质的转运,显著提高l-fabp的表达量,间接提高hdl-c的含量,使肝脏积累更多的脂质以进行外源性的卵黄合成。ldl-c的含量在卵黄发生中期的11月份和后期恢复并保持在一个较高的水平,脂质被转运到肝外组织而减少肝脏脂质过量积累。血脂水平在中期显著上升,并在11月份达到峰值,尤其是tg,几乎是前期的5.5倍以上,大量外源性脂质的摄入是造成这一结果的主要原因。后期外源性卵黄合成活动减弱,脂质摄入减少,血脂水平略有降低。产卵期,日粮pufas对肝脏hl和lpl的活力以及l-fabp的影响均不显著。hsl的活力逐渐降低,且受日粮的影响显著。hdl-c和ldl-c的含量则逐渐降低,血脂水平也在产卵后期降至最低。这与产卵期的卵黄发生基本停止,机体对能量需求大大降低有关。(3)对脂质转化利用过程的影响卵黄发生前期,肝脏fas活力最低,鱼油添加组显著高于3s∶0f组;卵黄发生中后期,fas活力逐渐升高,峰值出现在中期的9月份,达到前期的1.5倍以上,说明此时肝脏的脂质合成代谢活跃,中期的11月份,0s∶3f组显著高于1s∶2f组(p<0.05);0s∶3f组fas活力在卵黄发生后期,显著高于其余组(p<0.05)。说明卵黄发生的中后期,肝脏从头合成的能力受日粮pufas的影响显著。日粮pufas对肌肉脂肪酸成分的影响较肝脏要显著,在肝脏中受日粮pufas影响的只有c12∶0、c18∶2n6t、c22∶1n9、epa和n-3/n-6pufas,而在肌肉中除了c18∶2n6c,c18∶3n3,c23∶0和n-3/n-6pufas外,均受到日粮的显著影响(p<0.05)。肌肉中epa,dpa,dha,n-3pufas,mufas和sfas的最高含量均出现在0s∶3f组,是其余组的1.5倍以上(p<0.05);肝脏中0s∶3f组的epa和n-3/n-6pufas均在其余组的2倍左右(p<0.05)。肝脏中积累了大量的mufas(以c18∶1n9c为主)和sfas(以c16∶0为主),且肝脏中的脂肪酸种类要多于日粮和肌肉。综上所述,在本研究中使用豆油替代鱼油一定程度上是可行的,最适宜的替代比例组是2s∶1f组,在卵黄发生中后期,尤其是中期添加pufas最合适。