丙型病毒性肝炎（Hepatitis CHC）是一种严重危害人类健康的慢性肝炎之一，其病原体是丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）。全球HCV感染者约为1.3-1.7亿，每年新增30-40万感染人数。HCV感染后约50-85％发展为慢性肝炎，进一步可转化为肝纤维化、肝硬化、肝癌。HCV标准治疗方案是干扰素（Interferon，IFN）与利巴韦林联合使用。近年来，但随着新型直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral agents，DAA）在临床治疗中的运用，HCV治愈率得到了极大的提高。然而，迄今尚无HCV疫苗问世。　　HCV属于黄病毒科嗜肝病毒属，其基因组为全长约为9600nt的单正链RNA，只含有一个开放阅读框架。HCV感染肝细胞后，RNA复制的关键酶是RNA依赖的RNA聚合酶（RNA Dependent RNA Polymerase,RdRp），由于RdRp缺乏错误校对功能，HCV基因组在复制后出现极大的变异，因而造成同一患者的HCV基因组的核苷酸出现差异，被称为“准种”。HCV按照RNA序列可以分为7个主要型别（1、2、3、4、5、6、7型），各个型别之间的核苷酸差异约为31-35%，而且每个型别又可以继续分为多种亚型。HCV基因组高突变率的特点极大的阻碍了抗病毒药物和疫苗的研发。　　HCV包膜糖蛋白，分为E1和E2，嵌于脂质双分子层上，其中E2蛋白主要负责与肝细胞表面多种受体结合参与病毒入胞，也是该病毒刺激机体产生中和抗体—保护性体液免疫应答的主要抗原成分。由于多糖基化位点、二硫键以及高突变区的存在，E2蛋白晶体结构解析一直存在较大困难。最近几年，两个实验室相继解析了E2蛋白的核心结构区（E2 core region,E2c），促进了对E2蛋白空间结构的深入认识，也为利用E2c进行疫苗研制提供了基础。　　本文以已经解析的2a型HCV E2c的核苷酸序列为基础，对HCV中国流行株（河北株，1b型）E2核苷酸序列进行改造并基因合成，1bE2c经真核表达后，建立了检测HCV患者血清中特异性抗E2蛋白抗体水平的方法，并通过不同策略免疫小鼠后研究了其免疫学特性，为HCV预防性疫苗的研制提供新的思路及方法。同时建立了稳定表达膜型CD40L的K562细胞系和基于CCR5蛋白抗原表位展示分析技术，为分离E2c抗原特异性B细胞和抗原表位分析提供了实验基础。本研究主要研究方法及结果如下：　　1.河北株HCV E2蛋白核心区真核表达及其在血清检测中的运用　　参考文献报道2a型E2蛋白核心区序列修改方法，设计我国河北株1b E2蛋白核心区序列，通过在线工具模拟其三级结构，并使用Chimera软件进行结构比对，确定了1b型E2核心区序列。将其编码基因上游引入鼠免疫球蛋白先导序列(mouse IgK leader sequence,MK）分泌信号肽基因一并拼接合成后，克隆进入真核细胞表达载体pCI-neo，获得重组pCI-MK-E2c质粒。pCI-MK-E2c大量转染293T表达细胞系中表达后收集上清，Western Blot验证抗原特异性。在此基础上，建立了基于雪花凝集素（Galanthus Nivalis Agglutinin，GNA）改良的酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA），并初步用于HCV感染者血清中抗E2蛋白抗体的检测。结果显示：经过序列改造的1b E2c能够在真核细胞中表达并具有良好的免疫原性，基于GNA改良的ELISA方法能有效用于HCV感染者血清中抗E2蛋白的抗体检测。　　2.1b E2c蛋白质的免疫学特性研究　　IgG Fc段既有免疫佐剂的作用，又利于融合蛋白的纯化。首先将上述E2c与人IgG Fc段蛋白编码基因克隆进入真核表达载体pCI-neo，即pCI-E2c-Fc，大量扩增后转染293T细胞中进行表达，采用ProteinA/G琼脂糖珠进行纯化，获得重组E2c- Fc蛋白。Western Blot结果证实 E2c-Fc融合蛋白表达正确。然后将 pCI-MK-E2c、pCI-MK-E2c-Fc、E2c-Fc融合蛋白分为3组，分别采用单独基因免疫以及prime-boost免疫策略的方法研究E2c蛋白的体液及细胞免疫反应。结果表明：pCI-MK-E2c、和pCI-MK-E2c-Fc组产生的IgG2a及IgG1抗体水平均较低，而prime-boost免疫组诱导IgG1抗体较IgG2a高；三组均产生较高水平IFN-γ及IL-2水平，而prime-boost免疫组要明显高于其它两组。　　3.稳定表达膜型CD40L的K562细胞系的构建　　膜型CD40L联合IL-21共刺激的方法是体外扩增B细胞的有效方法之一。为构建膜结合CD40L稳定转染的细胞系，首先从外周血淋巴细胞中提取的总mRNA，反转录制备cDNA，以此为模板扩增CD40L胞外区基因，再通过重叠PCR方法将CD8先导肽编码基因和CD8跨膜区编码基因分别引入CD40L编码基因的5′和3′末端，克隆入慢病毒表达载体pLenti，获得pLenti-mCD40L-TM；然后以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）和博来霉素抗性基因（Zeocin）融合基因的表达载体为模板，扩增GFP-Zeocin(GZ)基因并克隆入pLenti-mCD40L-TM，获得pLenti-mCD40L-GZ；将pLenti-mCD40L-GZ与慢病毒包装质粒PSPAX2、PMD2.G转染293-T细胞，制备慢病毒。之后将慢病毒Lenti-mCD40L-GZ感染K562细胞，经过100μg/ml的Zeocin压力选择，4周之后获得稳定表达mCD40L细胞系，流式细胞术测定显示，约93.8%的细胞表达mCD40L-GZ融合蛋白。　　4.基于CCR5蛋白展示抗原表位分析技术的建立　　既有研究显示人C-C趋化因子受体5（C-C chemokine receptor type5,CCR5）是7次跨膜蛋白，其N端的14个氨基酸可以被其它短肽替换从而将该短肽展示在细胞表面。本研究首先将人CCR5蛋白编码基因经PCR引入表位基因克隆位点，克隆进入真核表达载体pCI-neo，获得pCI-epitop-CCR5；将其转染CHO细胞，免疫荧光显示它正确表达在细胞膜上。然后将HCV E2蛋白胞外区分为长度为14aa的多个短肽，分别将其编码基因克隆入pCI-epitop-CCR5，获得pCI-E2 epitop-CCR5文库。最后将上述质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)使其表达在细胞膜上，并用HCV感染者血清结合分析试验，结果显示：CCR5能够将抗原表位展示在细胞膜上，E2蛋白的抗原表位存在高反应区。　　综上所述，本研究成功构建了我国HCV河北株1bE2c的真核表达质粒，1bE2c基因与编码蛋白能够诱导较好的体液和细胞免疫应答，为设计HCV新型预防性疫苗提供的实验依据。建立的膜型CD40L稳定表达细胞系为下一步分离E2蛋白特异性B细胞提供了基础。基于 CCR5蛋白展示的抗原表位分析技术为深入分析不同患者的体液免疫应答及筛选优势表位奠定了基础。