研究目的1.骨髓间充质干细胞(MSCs)具有自我增殖和多向分化潜能,然而MSCs在骨髓中含量极少,如何在体外获得足够的、纯度较高的、生长状态良好的成人MSCs是进行各项研究的关键。课题拟建立一套简便可靠的成人MSCs分离、纯化、培养、扩增及鉴定体系,并定向诱导MSCs向成骨细胞分化。通过了解成人MSCs的部分生物学特性,可用于指导临床,并为后续利用干细胞组织工程学技术修复股骨头坏死奠定实验基础。2.中医药运用“整体观念”全身辨证治疗股骨头坏死已经取得了显而易见的优势,但是目前大部分中医临床工作者对于股骨头坏死整体观念的认识,仍然局限于基于临床证候的主观推导与枯燥中基理论的反复辨析,尚缺乏令人信服的客观实验依据,尤其是与坏死发生密切相关的全身细胞学改变尚未完全清楚,从而导致整体观念认知程度不高。本课题试图用找到一条途径,通过对激素性股骨头坏死患者MSCs活性的研究,为股骨头坏死整体观念提供客观实验依据。3.激素性股骨头坏死的发病机制尚未完全清楚,认识股骨头坏死的发病机制对于判断受累髋关节的预后、选择治疗方案至关重要。本课题试图从成人MSCs的增殖活性与成骨分化角度探讨并完善激素性股骨头坏死发病机制,并为之提供实验依据。研究方法1.抽取健康成人髂前上棘处骨髓,采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合,对MSCs分离、纯化、培养并扩增。倒置相差显微镜下观察MSCs的形态学,透射电镜观察细胞超微结构,MTT法检测不同代细胞的增殖活性,绘制生长曲线,流式细胞仪对第3代MSCs进行表面抗原鉴定。2.在前一部分实验的基础上,以适量地塞米松、p-甘油磷酸钠、维生素C配制成骨诱导液,诱导第3代MSCs向成骨细胞分化。检测成骨诱导后第4、8、12、16天ALP活性,采用ALP染色与茜素红染色鉴定成骨细胞。3.在前两部分实验研究的基础上,采用临床病例对照研究的方法与实验研究相结合,于2010年5月起按照设计的诊断标准、纳入标准和排除标准募集病例,骨坏死组为激素性股骨头坏死患者,正常对照组为无骨坏死且骨髓组织无异常的患者。两组病例行髂前上棘骨髓标本取材,均进行MSCs的提取、培养、扩增及诱导成骨细胞分化。对比观察两组细胞学形态；MTT法检测两组各入选对象第2代MSCs的增殖活性,绘制每组细胞平均生长曲线图；对各入选对象第3代MSCs进行成骨诱导,检测诱导后第4、12天细胞的ALP活性。以上各检测项目进行两组病例的组间比照。研究结果1.成人MSCs呈现长梭形、纺锤状,原代培养早期为集落样生长,8-11天左右细胞进入快速增殖期,逐渐融合成片,排列有一定方向性。2.传代培养的MSCs第0-2天为生长潜伏期,3-7天为对数增长期,8-9天进入平台期。生长曲线呈S型,在5代之前具有较好的生长特性。随着传代次数增加,细胞的生长状况有衰减的趋势。3.透射电镜显示MSCs表面粗糙,可见较多的微绒毛突起。细胞核大,不规则,常偏于一侧,细胞胞质丰富,各种细胞器成熟,有大量核糖体、粗面内质网和较多的线粒体,可见大量蛋白分泌物。4.流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达,成人MSCs相对特异性抗原CD44的阳性表达为94.81%,CD90的阳性表达为93.15%,而几乎不表达造血细胞表面抗原标志CD34、CD45(分别为2.87%、2.02%)。5. MSCs成骨诱导后,细胞形态较不规则,诱导7天左右出现聚集成团生长,细胞之间连接致密,约14-20天后形成钙化结节。6.成骨诱导4天后ALP活性即有所提高,ALP活性随培养时间而增高,并在第12天时达到高峰,各时间点成骨诱导组ALP活性均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。成骨细胞ALP染色、茜红素染色均呈阳性。7.骨坏死组与正常对照组的MSCs生长状态有明显不同,正常对照组原代细胞集落数目明显多于骨坏死组,细胞密度较高,倍增较快；而骨坏死组集落形成较慢,个数少,较稀疏,细胞倍增较慢。成骨诱导后正常对照组一般7天左右可见细胞团块形成,而骨坏死组细胞团块出现时间较晚,约在10天左右形成。8.骨坏死组MSCs在不同时间的平均增殖活性要低于正常对照组,从第3天起差异有统计学意义(P<0.05)；两组细胞平均生长曲线图提示,骨坏死组MSCs增殖速度缓慢,对数生长期缩短,平台期提前。9.成骨诱导后,随时间推移,骨坏死组与正常对照组的ALP活性均逐渐提高,符合MSCs向成骨细胞分化的特性。但处于同一时间段,骨坏死组的平均ALP活性均低于正常对照组,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论1.采用密度梯度离心法可以获得纯度较高的单个核细胞,再根据MSCs的贴壁特性,经过换液、消化、传代可以进一步将MSCs纯化。在加有成骨诱导剂的培养基里可以分化为成骨细胞。本实验建立的成人MSCs体外培养、鉴定及诱导成骨细胞分化体系,可以获得纯度较高、成骨分化能力较好的MSCs。2.与正常人相比,骨坏死组病例MSCs增殖活性与成骨分化能力均下降,这在激素性股骨头坏死的发病机制中可能起到重要作用。3.激素性股骨头坏死患者MSCs活性的异常可能是全身性的而并不仅仅局限于股骨头周围,股骨头坏死是由激素引起的全身性病理改变的一个局部反映,“整体观念”可以获得客观的细胞学实验证据的支持。