现代医学技术的发展，已经显著地提高了肿瘤病人的期望寿命。年轻的肿瘤病人经过大剂量化疗或放疗后，面临着丧失生育能力的危险。到目前为止，有数种方法可为有可能出现卵巢早衰和牛育力丧失的女性保存生殖功能，包括胚胎、卵子及卵巢组织的冷冻保存等。其中，冷冻保存年轻女性患者的卵巢组织作为恢复这些患者生育能力意义重大且较有前景的一种方法，越来越受到生殖领域的关注。 近年来，人冻融卵巢组织临床应用取得很大进展，文献已经报道两名婴儿通过卵巢组织自体原位移植冻融卵巢组织获得妊娠分娩。目前国外许多中心将女性肿瘤患者大剂量化疗或放疗之前进行卵巢组织片的冷冻保存作为常规。 大多数冻融卵巢组织自体移植是为了恢复肿瘤患者的生育能力，但某些恶性肿瘤患者卵巢中可能存在微小残余癌灶，能将恶性肿瘤细胞植入并导致肿瘤的复发，而冷冻保存不会降低肿瘤复发的比例。有些肿瘤如白血病、乳腺癌、神经母细胞瘤的再种植风险比较高。肿瘤细胞再种植的风险与肿瘤的类型，活动性及分级有关。 影响卵巢组织移植成功率的主要原因之一是移植后缺血再灌注损伤导致的卵泡丢失。卵巢组织冻融保存和移植是没有血管吻合的组织皮质片移植，移植后的组织存活完全依赖周围毛细血管的生长。研究发现移植后卵巢中卵泡的丢失主要是在血管再形成过程中缺血再灌注损伤所致，而非直接的冷冻损伤。移植后卵巢组织中卵泡的丢失可达50-75％。防止肿瘤细胞的传播及尽可能将缺血组织损伤降到最低对于冻融组织的临床成功应用非常重要。 为了避免恶性细胞的传播，体外培养卵巢组织及卵泡成熟是一个很有吸引力的方法。但在人类，从原始卵泡到成熟卵母细胞的体外成熟是一个极大的挑战，因为原始卵泡体外培养需要时间过长，卵细胞成熟的机制也还未阐明。到目前为止，只有小鼠始基卵泡完全在体外培养出生子代的报道。 由于人卵巢间质纤维的致密性，将卵泡从周围组织中分离出来是比较困难的。1997年Oktay第一次用温和的胶原酶联合机械分离得到较多的分离的原始卵泡。然而，将经胶原酶消化分离后得到的卵泡，不论是完全分离的卵泡还是部分分离卵泡，用各种不同的基质进行培养，卵泡在24小时左右就发生变性。这时我们希望尝试使用另外一种策略，就是移植经酶解得到的分离小卵泡。在小鼠，移植经酶消化后的卵巢悬浊液可以得到一个形态上可以辨认的卵巢样组织，卵巢功能得到恢复，并得到正常的子代小鼠。本研究旨在通过异种移植分离的窦前小卵泡，了解经过酶解后得到的分离小卵泡的生长和发育潜能。研究内容共包括两部分： 第一部分分离的人窦前小卵泡异种移植到裸鼠的短期观察 目的 本研究的目的是评价人卵巢组织经酶分离后的卵泡异种移植到裸鼠的生长和发育能力。 建立异种移植的方法来评价卵巢组织经酶分离得到的窦前小卵泡的生长潜能。 方法 1.实验设计：为了比较分离的卵泡异种移植后卵泡的生长，卵巢标本分为三组： 1)未移植卵巢组织组：取到标本后立即固定于福尔马林；2)移植的卵巢皮质片组：移植到裸鼠的右侧卵巢囊；3)分离的卵泡移植组：将分离的卵泡包埋在血浆凝块，移植到同只裸鼠的左侧卵巢囊。 2.卵泡的分离：用0.04mg／ml IAberase(R)消化75分钟，将卵泡吸出，尽可能将间质细胞全部去除。 3.移植物的准备及移植：将卵泡加入到同一病人来源的血浆，诱导血浆形成凝块，异种移植到裸鼠。 4.组织学检查：光学显微镜下观察并记录卵巢组织切片中卵泡的分级及形态。 5.免疫组化检测：1)通过计算Ki-67免疫组化染色阳性卵泡的百分率来评价卵泡增生的情况；2)用CD34双重免疫组化染色了解移植物中新生血管的情况，并用Image J软件行血管计量学分析；3)为了明确卵泡周围间质样细胞的来源和性质，用抗人Vimentin进行免疫组化染色。 6.用人特异性基因组探针行FISH测定进一步证实分离的卵泡移植物中是否存在来源于人的问质样细胞。 结果 1.移植7天后从12只小鼠中回收双侧卵巢囊组织。卵巢皮质片移植组共回收到9个移植物，回收率75％；分离的卵泡移植组回收到7个移植物，回收率58.3％；经卡方检验，p>0.05。 2.卵巢皮质片移植组中，9个移植物共回收到329个卵泡，平均每个移植物回收到36.5±27个卵泡。分离的卵泡移植组中，7个移植物共回收到125个卵泡，平均每个移植物回收到17.9±10.4个卵泡。平均每个卵巢囊移植了88个卵泡，因而回收卵泡存活率为20.3％。 3.未移植组中原始卵泡所占百分率71％，移植7天后明显下降，在卵巢皮质片移植组下降至39％，卵泡移植组下降至13％(p<0.001)。 对于初级卵泡，从未移植组的11％，升高到卵巢皮质片移植组的24％和卵泡移植组的56％(p=0.05 and p<0.001)。 4.在未移植组中，只有8％的卵泡颗粒细胞呈Ki．67阳性，移植l周后卵巢皮质片移植组这个比例上升到71％，卵泡移植组的比例为67％(p<0.001)。在每组的各阶段，包括原始卵泡、中间型卵泡、初级卵泡和次级卵泡阶段，与未移植组比较，移植1周后，各卵泡阶段Ki-67阳性卵泡的比例都有上升。 5.CD34双重免疫组化染色分析显示，卵巢皮质片移植组及卵泡移植组均可见新生血管的形成，血管计量学分析两组间血管密度和血管表面积的比较无统计学差异。 6.在分离的卵泡移植组，间质样细胞抗人vimentin免疫组化染色呈阳性，说明这些细胞来源于人。 7.用人特异性基因组探针行FISH检查进一步证实分离的卵泡移植物中间质样细胞中有来源于人的细胞。结果显示分离的卵泡移植物的间质样组织中有许多人X染色体杂交信号阳性的细胞，证实在卵泡周围的间质样细胞中有许多来源于人的细胞。 结论 1.经酶解后分离的人窦前小卵泡异种移植后1周，卵泡可以存活并继续生长； 2.用异种移植的方法来评价卵巢组织经酶解后分离的小卵泡的生长潜能是可行的； 3.卵巢皮质片移植组和卵泡移植组异种移植后，均存在卵泡激活的现象； 4.移植1周后卵巢皮质片移植组和卵泡移植组均有新牛血管形成； 5.分离的人窦前小卵泡异种移植到小鼠后，卵泡周围存在来源于人的问质样细胞。 第二部分分离的人窦前小卵泡异种移植到SCID鼠的长期观察 目的 本部分研究的目的是评价经酶消化后的卵泡移植到SCID鼠5个月后的发育潜能，以及给予促性腺激素刺激后是否能够发育到窦卵泡阶段。 方法 1.卵泡分离：窦前小卵泡的分离同第一部分。每一份标本平均分成两部分。一半使用Liberase(R)0.04mg／ml，消化75分钟；另一半使用胶原酶1 mg／ml，消化60分钟。 2.异种移植：将采用胶原酶分离后卵泡所得的血浆凝块移植入SCID鼠的右侧卵巢囊，采用Li berase(R)分离后卵泡所得血浆凝块移植入小鼠左侧卵巢囊。 3.FSH的使用：用7.5 IU重组FSH隔天腹腔内注射，持续两周。小鼠A和小鼠B取出双侧卵巢囊组织后固定于福尔马林行组织学检查。小鼠C的双侧卵巢囊组织取出后以戊二醛固定行电子显微镜检查。 4.组织学检查了解卵泡发育的阶段和状态。 5.电子显微镜观察了解移植物的超微结构。 6.免疫组化染色：抗人特异性Vimentin免疫组化染色明确卵泡周围间质样细胞的来源。Ki-67免疫组化染色了解卵泡增生的情况。CD34双重免疫组化染色了解移植物中血管供应的情况。 结果 1.6个移植物回收到4个。在4个移植物中移植了290个卵泡，一共回收到84个卵泡：11个原始卵泡，38个初级卵泡，32个次级卵泡和3个窦卵泡。一共移植了290个卵泡，回收率28.96％。 小鼠A，左侧移植了88个用Liberase(R)分离的卵泡，5个月后回收到1个窦卵泡，卵泡回收率1.14％；小鼠B，右侧卵巢囊移植了用胶原酶分离的59个卵泡，回收到31个卵泡(6个原始卵泡，11个初级卵泡，13个次级卵泡和1个窦卵泡)，左侧卵巢囊移植了用Liberase(R)分离的53个卵泡，回收到13个卵泡(4个初级卵泡，9个次级卵泡)，小鼠B卵泡回收率39.28％；小鼠C，左侧卵巢囊移植了用Liberase(R)分离的90个卵泡，回收到39个卵泡(5个原始卵泡，23个初级卵泡，10个次级卵泡和1个窦卵泡)，卵泡回收率43.33％。 2.组织学切片上看到，移植物中卵泡周围存在似卵巢间质样细胞，结构上与卵巢皮质片移植后相似。 3.电镜下，原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡结构基本正常。 4.免疫组化染色：在次级卵泡和窦卵泡的颗粒细胞都有很明显的Ki-67染色，说明这些卵泡还没有停止生长。 在分离的卵泡移植，围饶在卵泡周围的一些间质样细胞呈抗人Vimentin 染色阳性，说明这些问质细胞来源于人。 次级卵泡及小窦卵泡周围发现较多的毛细血管网形成，CD34双重免疫组化染色显示这些血管来源于小鼠。 结论 1.人卵巢组织酶分离得到的窦前小卵泡，异种移植到SCID鼠5个月后仍然能保存他们的发育潜能。 2.异种移植后卵泡周围间质样细胞中，存在来源于人的细胞，这个结构可以支持移植后卵泡的生长，直至窦卵泡阶段。