口腔粘膜鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是严重威胁人类健康的癌症之一。尽管近年来在治疗方法上取得了较大的进展,但其五年生存率仍然徘徊在55%～60%。研究发现吸烟是诱发OSCC的重要危险因素之一,而且长时间接触烟草的OSCC患者,治疗后复发率和第二原发癌发生的危险性也明显升高。此外,有学者研究证实烟草中致癌物质可能与OSCC患者DNA甲基化水平有关。众所周知,作为一种重要的肿瘤表观遗传学机制,DNA甲基化水平或模式发生变化,包括基因组整体甲基化水平降低所导致的原癌基因激活、突变热点形成、转座子异常表达以及基因组不稳定性等,都会对肿瘤的发生有促进作用。Wnt信号通路与多种人类肿瘤的发生、发展和形成具有密切的关系。分泌型卷曲相关蛋白家族(secreted frizzled-related proteins,SFRPs)是一种分泌型糖蛋白,能够通过竞争结合Wnt蛋白受体或直接与Wnt蛋白结合,影响该信号通路的生物学功能。SFRP2基因是SFRPs家族成员之一,该基因定位于染色体4q31.3,具有3个外显子和2个内含子,第1外显子附近有密度较高的CpG岛。研究认为,SFRP2基因启动子区CpG岛的甲基化,能够下调SFRP2的表达,从而导致对Wnt通路的抑制作用减弱,引起细胞的过度增殖,诱发肿瘤的发生和发展。多项研究表明,SFRP2基因甲基化水平与结肠癌、食管癌、胃癌等多种肿瘤的发生、发展及预后有关。本课题旨在通过以下四个部分的研究,从体外和体内两个层次系统探讨SFRP2基因甲基化水平在OSCC发生发展中的作用及其分子机制。类似研究国内外尚未见报道。第一部分：口腔鳞癌组织中SFRP2基因甲基化的发生及其临床意义目的：探讨Wnt通路拮抗基因家族分泌型卷曲相关蛋白——SFRP2基因在口腔鳞癌组织中的甲基化状态及其临床意义。方法：收集2010年10月至2011年8月于苏州大学某医院口腔科手术治疗、经病理确诊为OSCC的肿瘤组织49例以及与其相配对的癌旁正常组织49例。采用甲基化特异PCR法(methylation-specific PCR,MSP)及亚硫酸氢盐处理后测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测口腔鳞癌及癌旁正常组织中SFRP2基因的甲基化状态,分析SFRP2基因甲基化与相应临床病理特征之间的关系。采用RT-PCR法检测SFRP2mRNA表达情况,并分析其与SFRP2基因甲基化之间的关系。结果：MSP检测结果显示,口腔鳞癌组织中SFRP2基因甲基化的发生率为75.51%(37/49),明显高于癌旁正常组织(6.12%；3/49)。通过对BSP产物进行克隆和多次核酸序列测定,进一步证实癌组织中SFRP2基因启动子在CpG岛的甲基化程度明显高于癌旁组织(P<0.01)。此外,SFRP2基因甲基化与临床分期相关,重度吸烟患者的肿瘤组织中SFRP2基因甲基化的发生率较高。RT-PCR结果表明,口腔鳞癌组织中SFRP2mRNA表达缺失率为85.71%(42/49),而相应的癌旁组织均有SFRP2mNRA表达。37例发生SFRP2基因启动子甲基化的口腔鳞癌组织中mRNA表达缺失率为94.59%(35/37),未发生SFRP2基因启动子甲基化的癌组织中表达缺失率为41.67%(5/12),差异具有显著性(P<0.05)。结论：口腔鳞癌组织中SFRP2基因启动子区呈现高甲基化状态,而且其mRNA表达水平明显下调。提示该基因的甲基化可能是其基因失活的主要机制之一,而且吸烟与SFRP2基因的甲基化可能有一定相关性。第二部分：5-Aza-dC对口腔鳞癌细胞Tca8113增殖、凋亡及SFRP2基因甲基化的影响目的：观察5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)对体外培养的人舌鳞癌细胞系Tca8113中SFRP2基因的甲基化状态和mRNA表达的作用,并研究5-Aza-dC对人舌鳞癌细胞Tca8113的增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法：用不同浓度的5-Aza-dC处理体外培养的人舌鳞癌细胞系Tca8113。24h后,采用MSP法检测、比较5-Aza-dC处理前后SFRP2基因的甲基化状态；采用RT-PCR法和Western blot法检测细胞中SFRP2mRNA及蛋白表达的变化情况；采用MTT法和克隆形成实验检测细胞的增殖活性；采用流式细胞仪分析细胞周期分布及细胞凋亡的变化。结果：体外培养的人舌鳞癌细胞系Tca8113中SFRP2基因启动子区域高度甲基化,而且SFRP2mRNA和SFP2蛋白的表达均处于较低水平。经5-Aza-dC处理之后,SFRP2基因甲基化状态得到明显逆转,SFRP2mRNA和蛋白的表达水平也逐渐增加,并呈现出5-Aza-dC药物浓度依赖性。MTT法和克隆形成实验发现,不同浓度的5-Aza-dC处理后,Tca8113细胞生存率逐渐下降,细胞生长抑制率逐渐上升,细胞生长变慢。流式细胞仪检测结果表明,不同药物浓度处理24h后Tca8113细胞周期与对照组相比发生明显的G1期阻滞与细胞凋亡,并同样呈现药物浓度依赖关系。结论：在人舌鳞癌细胞系Tca8113中,同样呈现SFRP2基因启动子区高度甲基化和其mRNA和蛋白表达水平的下调。5-Aza-dC能够逆转Tca8113细胞中SFRP2基因的甲基化状态,并能恢复其mRNA和蛋白的表达。同时,5-Aza-dC可抑制Tca8113细胞增殖,改变细胞周期分布,促进细胞凋亡,其机制可能与该药物对SFRP2基因的去甲基化作用有关。第三部分：SFRP2基因在口腔鳞癌细胞Tca8113中的生物学功能及其机制的研究目的：研究SFRP2基因在Tca8113中的生物学功能及可能的分子机制,为进一步研究该基因在OSCC发生发展中的作用提供更多的实验依据。方法：构建能够表达SFRP2的重组质粒pcDNA3.+/SFRP2,并设计、合成SFRP2小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),通过脂质体介导转染Tca8113细胞。采用RT-PCR和Western Blot法分别检测细胞中SFRP2的mRNA和蛋白的表达情况,建立高表达SFRP2的细胞模型Tca8113/SFRP2口SFRP2基因敲减的体外细胞模型。采用Western Blot检测Wnnt信号通路中相关蛋白分子的表达情况。采用MTT法和克隆形成实验研究该基因对细胞增殖的影响,并采用流式细胞仪分析SFRP2的表达水平与细胞周期分布之间关系。结果：成功构建真核表达质粒pcDNA3.1+/SFRP2,经测序鉴定后转染Tca8113细胞,通过G418筛选,获得稳定高表达SFRP2的人舌鳞癌细胞Tca8113/SFRP2。同时,通过对siRNA的筛选,成功获得能够有效抑制Tca8113细胞中SFRP2表达的siRNA.Western blot检测结果显示SFRP2高表达能够引起Wnt信号通路中磷酸化GSK-3p和β-catenin的表达增加,并降低通路下游关键效应因子Cyclin D1的表达水平；而采用siRNA敲减Tca8113细胞中SFRP2基因,则能够导致磷酸化GSK-3β和β-catenin表达水平的下降,但对Cyclin D1的表达无显著影响。此外,SFRP2过表达可显著抑制Tca8113细胞的增殖,引起细胞周期G1期阻滞；而敲减SFRP2表达,则能够促进Tca8113细胞的增殖,并引起细胞周期S期比率增加。结论：SFRP2能够调控Tca8113细胞的增殖周期,抑制Tca8113细胞的体外增殖,其机制可能部分与影响Wnt信号通路中信号蛋白分子GSK-3β,β-catenin的磷酸化和Cyclin D1的表达有关。第四部分：口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型中SFRP2基因功能研究目的：研究在裸鼠中,SFRP2基因对人口腔鳞癌移植瘤形成的抑制作用及相关分子机制。方法：体外培养稳定高表达SFRP2的Tca8113/SFRP2细胞株和空质粒转染的细胞株Tca8113/pc3.1,并分别将指数生长期的上述细胞接种于20只裸鼠右前肢皮下(每种细胞株接种10只),建立裸鼠移植瘤模型。成瘤后每3d测量瘤体长径a和短径b,按照公式V=ab2π/6计算瘤体积,绘制肿瘤增殖曲线。第28d安乐死处死动物,完整解剖出瘤块,常规进行固定、石蜡包埋与切片,经HE染色观察其组织病理学特征,并采用免疫组织化学法检测各组标本中Ki67、β-catenin、Cyclin D1的表达情况。结果：成功建立Tca8113/SFP2和Tca8113/pc3.1裸鼠移植瘤模型,形成的体内肿瘤具有典型的口腔鳞癌组织病理学特征。结果表明,SFRP2高表达虽然不能抑制裸鼠体内OSCC的体内成瘤,但与空质粒对照组相比,能显著抑制移植瘤的增殖(P<0.05)。免疫组化结果显示,与Tca8113/pc3.1组相比,Tca8113/SFRP2组小鼠体内Ki67和Cyclin Dl表达水平明显降低,而胞浆与胞膜β-catenin的表达水平明显增高。结论：本部分研究首次证实,SFRP2能够通过调控细胞周期并部分的影响Wnt信号通路,抑制OSCC在裸鼠体内的形成和发展。