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目的:构建载体表达shRNA以沉默TGF-β1的表达,观察其减少系膜细胞表达纤维连接蛋白(Fn)和Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的作用,探讨用shRNA防治肾脏纤维化的新途径。方法:针对SD大鼠TGF-β1 mRNA的538-556和895-913的核苷酸序列构建表达shRNA的载体、转染SD大鼠系膜细胞,通过RT-PCR动态观察系膜细胞TGF-β1和Fn的mRNA的变化、通过ELISA动态观察TGF-β1、Fn和Col-Ⅳ蛋白的变化,同时用Western Blot进一步证实TGF-β1、Fn的改变。结果:通过对构建的3个质粒进行DNA测序发现,针对SD大鼠TGF-β1 mRNA的538-556和895-913的2条序列之一或二已被分别成功地插入了相应的质粒pEGFP6载体中;将已构建好的3个载体分别转染813大鼠系膜细胞后,发现2条干扰序列中,只有针对TGF-β1mRNA 538-556的干扰序列,具有显著的干扰效应,表现为沉默TGF-β1mRNA效应持续48hrs(RT-PCR)、沉默TGF-β1蛋白分泌(细胞上清)持续48hrs、沉默细胞内TGF-β1蛋白持续到72hrs。相应地,TGF-β1的有效沉默有效地延缓了脂质体刺激所导致的Fn分泌峰值的出现,而系膜细胞总Col-Ⅳ蛋白的表达在24hrs、48hrs也显著性下调。结论:针对SD大鼠TGF-β1 mRNA538-556序列构建的shRNA表达载体pEGFP6,能够有效沉默系膜细胞TGF-β1的表达,伴Fn和Col-Ⅳ蛋白表达的显著下调,可能具有显著的抗纤维化效应。目的:为了沉默系膜细胞TGF-β1 mRNA的表达,构建针对SD大鼠TGF-β1基因的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体pEGFP6 vector,以便于用该载体转染SD大鼠系膜细胞,在系膜细胞内表达shRNA发挥沉默效应。方法:针对SD大鼠的TGF-β1 mRNA的538-556和895-913核苷酸序列,分别设计2段各含有19nt的干扰序列。在体外按照5′→3′方向人工合成依序为干扰序列正义链(或反义链)、Loop环和反义链(或正义链)及相应部位的多克隆酶切位点和终止信号,得到小发夹cDNA正义链(或反义链)长链结构,然后将合成的小发夹cDNA正、反义链混合、高温融解、退火得到小发夹cDNA(small hairpin cDNA)双链,再用T4 DNA连接酶将其插入pEGFP6-1或pGEGP6-4 VectorU6的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,重组体转化大肠杆菌DH5α,筛选kana抗性克隆,提取质粒,分别对构建的表达载体进行酶切、测序,确认得到两种能够表达一条干扰序列的质粒,然后再继续将这两个质粒进行SalI+PstI双酶切,分别回收含有两个干扰序列的大、小片段,用T4DNA连接酶连接、转化大肠杆菌DH5α、筛选kana抗性克隆、提取质粒,再行酶切和DNA测序鉴定。结果:酶切和DNA测序证实,针对SD大鼠TGF-β1 mRNA的两个序列已分别(表达单条)或同时(表达2条)正确地插入了pEGFP6质粒中。结论:分别得到了能够表达单条shRNA的质粒2个或同时表达2条shRNAs的质粒1个。目的:用构建好的能够表达TGF-β1 shRNA的pEGFP6质粒转染SD大鼠系膜细胞,动态观察其沉默系膜细胞TGF-β1的效应情况。方法:通过使用脂质体Lipfectamine TM2000将表达TGF-β1 shRNA的pEGFP6质粒转染SD大鼠系膜细胞,然后分别在24hrs、48hrs、72hrs时间段内观察系膜细胞表达TGF-β1的变化:分别用RT-PCR和ELISA测定观察系膜细胞TGF-β1 mRNA半定量和细胞培养上清中TGF-β1蛋白的动态变化,用Western Blot测定72hrs时间段内系膜细胞内TGF-β1的表达。最后通过SPSS10.0统计学软件做统计学处理,找出干扰效应最好的干扰序列和时间段。结果:针对SD大鼠TGF-β1 mRNA位点538-556的shRNA,能够显著性地沉默系膜细胞TGF-β1的表达,其中沉默TGF-β1的mRNA效应持续48hrs(RT-PCR)、沉默TGF-β1蛋白分泌(细胞上清ELISA)持续48hrs、沉默细胞内的TGF-β1蛋白持续到72hrs;而针对SD大鼠TGF-β1 mRNA位点895-913的shRNA没有显示出明显的特异性干扰效应;能够同时表达上述2条干扰序列的质粒载体,显示出了二者干扰效应的叠加倾向。结论:针对SD大鼠TGF-β1 mRNA位点538-556的特异性shRNA能够在mRNA和蛋白水平上显著性沉默SD大鼠TGF-β1基因的表达;表达2条干扰序列的质粒载体,显示出干扰效应叠加的倾向。目的:在shRNA有效沉默TGF-β1情况下,观察系膜细胞表达纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)和四型胶原(typeⅣcollage,Col-Ⅳ)的动态变化。方法:在表达TGF-β1 shRNA的pEGFP6质粒转染SD大鼠系膜细胞后,观察系膜细胞表达Fn和Col-Ⅳ的变化及其与TGF-β1沉默效应的关系,对于24hrs、48hrs和72hrs系膜细胞的Fn mRNA表达及细胞培养上清中的Fn和Col-Ⅳ蛋白浓度,分别采用RT-PCR和ELISA方法动态观察。结果:在脂质体Lipfectamine TM2000刺激下,除了TGF-β1被有效沉默的2组外,各组系膜细胞分泌Fn显著增加,并于24hrs达到峰值浓度,而TGF-β1被有效沉默的2组的Fn升高没有前者明显(P<0.01),其峰值浓度被推迟到48hrs才出现;各组的Fn mRNART-PCR半定量也呈现出类似的变化。各组系膜细胞蛋白提取液中ELISA测定Col-Ⅳ蛋白提示,TGF-β1被有效沉默的2组均出现了Col-Ⅳ的显著下降,以24hrs、48hrs为明显,72hrs仍有低于对照组的倾向,但无统计学差异。结论:shRNA沉默TGF-β1的表达,能够显著下调Col-Ⅳ的表达,延缓Fn峰值的出现。脂质体Lipfectamine TM2000可能通过TGF-β1非依赖途径刺激系膜细胞分泌Fn。