刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是一种寄生于海水鱼类的纤毛虫,能够引起海水养殖鱼类的刺激隐核虫病,俗称“白点病”,给我国东南沿海海水养殖渔业造成巨大的经济损失。免疫预防目前被认为是一种安全有效的防治刺激隐核虫病的技术手段,寻找保护性抗原是疫苗研制的主要工作。基因组学、转录组学以及蛋白质组学等技术日新月异的发展,有助于我们从刺激隐核虫中筛选出大量具有免疫原性的保护性抗原。本文在现有嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)基因组的基础上,采用Solexa mRNA测序技术对刺激隐核虫幼虫(theront)、滋养体(trophonts)以及包囊(tomont)的转录组进行测序。将刺激隐核虫三个生活时期的测序数据拼接一共得到49104条unigene,BLAST x比对结果显示有42.85%的unigene在UniProt数据库得到注释,48.5%的unigene与嗜热四膜虫和草履虫(Paramecium tetraurelia)等纤毛虫高度相似。按照基因本体注释(gene ontology annotation)的功能分类,有12565条unigene被注释上25种KOG分类中。本文从刺激隐核虫显著差异表达基因中的差异表达基因富集信号通路途径中,选择参与表达基因数目最多的代谢途径(Metabolic pathways)、核糖体(Ribosome)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)以及多种环境下微生物新陈代谢(Microbial metabolism in diverse environments)这4种信号通路途径,而这些信号通路途径涉及的unigene可能与刺激隐核虫病的形成发生这一生理过程紧密相关,一共筛选出27个与刺激隐核虫病形成发生相关的差异表达基因,包括40s核糖体蛋白(40sribosomalprotein)、60s核糖体蛋白(60sribosomalprotein)、核糖体蛋白(ribosomalprotein)、泛素结合酶(ubiquitinconjugatingenzyme)、阻动抗原前体(agglutination/immobilizationantigenprecursor)、蛋白激酶结构域蛋白(proteinkinasedomainprotein)、dnak蛋白(dnakprotein)、tnfr/ngfr富含半胱氨酸区域家族蛋白(tnfr/ngfrcysteine-richregionfamilyprotein)等。本文运用传统的双向凝胶电泳技术(two-dimensionalelectrophoresis,2-de)与常规的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,maldi-tofms)相结合,对刺激隐核虫幼虫、滋养体以及包囊三种生活时期的蛋白质组进行了差异蛋白质组分析并两两比对,结果显示,86个鉴定成功的显著差异表达蛋白点属于44种蛋白质,其中11种蛋白与刺激隐核虫高度相关,如微管蛋白(tubulin)、肌动蛋白(actin)、v型atp合酶催化亚基α(v-typeatpasecatalyticsubunitα)、烯醇化酶(enolase)和热激蛋白70(heatshockprotein70)、蛋白激酶结构域蛋白(proteinkinasecontainingprotein)、mcm2-3-5家族蛋白(mcm2-3-5familyproteins)、26s蛋白酶体亚基p45家族蛋白(26sproteasomesubunitp45familyprotein)是潜在的保护性抗原,是刺激隐核虫病免疫预防的疫苗候选分子及作用靶点。本文运用免疫蛋白组技术筛选刺激隐核虫潜在疫苗候选分子,其中刺激隐核虫幼虫、滋养体以及包囊蛋白与相应的兔抗血清产生免疫反应的蛋白点有84个,质谱成功鉴定出60个蛋白点,对应9种蛋白,包括肌动蛋白、α-微管蛋白、β-微管蛋白、热激蛋白70、线粒体热激蛋白70、v型atp合酶催化亚基α、dnak以及2种功能不明的未知蛋白。同时,刺激隐核虫幼虫蛋白分别与自然感染以及注射疫苗两种方式制备的石斑鱼抗血清进行免疫杂交,具有共同免疫原性蛋白点有28个,质谱成功鉴定27个,对应11种蛋白,包括β-微管蛋白、烯醇化酶、多嘧啶尾端结合蛋白(polypyrimidinetract-bindingprotein)、蛋白激酶结构域蛋白、tnfr/ngfr富含半胱氨酸区域家族蛋白、v型atp合酶催化亚基α、nadh-泛醌氧化还原酶75kda亚基(nadh-ubiquinoneoxidoreductase75kdasubunit)、谷氨酰胺合成酶催化亚基(glutaminesynthetase,catalyticdomaincontainingprotein)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)以及2种功能不明的未知蛋白。本文将上述通过转录组以及蛋白质组筛选出来的保护性抗原,以转录组数据收录的unigene为模板,最终成功扩增4种具有潜在免疫原性的保护性抗原的ORF全长,分别是肌动蛋白、烯醇化酶、dnaK、26S蛋白酶体亚基P45家族蛋白。经过氨基酸同源性比对后,分别得到了3、6、3、3个高度保守的共同抗原决定簇,有利于后续多价疫苗的研究和开发。