脑血管疾病具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高等特点,是威胁人类健康的重大疾病之一。其中,缺血性中风病呈上升趋势。因此,研究缺血性脑血管病具有十分重要的意义。研究发现,脑缺血后,神经胶质细胞和神经元分泌大量具有神经营养活性的神经营养因子(NTFs),NTFs 能够从多途径对抗脑缺血损伤并促进损伤后神经元的修复。但由于NTFs 多为大分子肽,难以通过血脑屏障,因此外周给药难以到达作用部位。而脑内给药又会加重缺血损伤,且操作复杂。所以,充分诱导内源性NTFs 及其受体的表达,可能是治疗缺血神经元损伤的重要途径。基于以上认识,本课题进行了清开灵有效组分抗大鼠局灶性脑缺血损伤的神经营养机制研究。论文分为两部分:第一部分系统分析了线栓法大脑中动脉梗塞(MCAO)模型的特点与问题,脑缺血后胶质细胞反应和神经营养因子的表达及其神经保护机制,以及中药复方的研究现状。线栓法MCAO 模型是研究脑缺血的标准动物模型。模型成功的关键在于控制大鼠的体重和鼠龄。此外,动物的品系、尼龙线直径的选用、制备方法、放置方法及放入深度等因素,直接影响模型的成功率。胶质细胞在脑缺血后异常活跃,半暗带神经元死亡原因可能首先是胶质细胞功能异常。脑缺血损伤所激发的胶质细胞反应极其复杂,有独特的时间和空间模式。激活后的胶质细胞发挥“双刃”效应。一方面,它们能缓冲神经元释放的毒性物质,分泌神经营养因子保护神经元;另一方面,它们释放的一些细胞因子也具有毒性作用,加重神经元损伤。脑缺血后,NMDA 受体激活及Ca2+ 内流等因素触发了多种NTF及其受体表达上调,并通过稳定细胞内Ca2+浓度、抗自由基损伤、抗细胞凋亡、增强蛋白激酶C 的活性、修复受损神经元等机制起到保护受损神经元的作用。中药复方的药效物质基础及作用机理研究已成为当今学术界瞩目的焦点。虽然多年的探索已经给予我们不少经验、教训和启发,但是我国中药复方的研究与开发仍然没有突破性的进展,目前还存在着相当大的问题。中药复方研究的思路与方法出现多样化趋势,并引起学术界广泛关注。第二部分采用线栓法大鼠MCAO 模型,围绕神经营养因子,从不同家族、同一家族的不同成员、同一成员的因子及其受体三个层次,探讨了清开灵有效组分抗局灶性脑缺血损伤的神经营养机制及效应特征。综合分析实验结果,得出以下结论:1. 清开灵有效组分可促进脑缺血后早期星形胶质细胞(Ast)的活化。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是Ast 所独有的细胞骨架蛋白,是Ast 中主要的中间丝蛋白,被认为是Ast 的特征性标志。钙结合蛋白S-100β的表达上调是Ast 功能活化的重要标记。脑缺血12h,各用药组可上调GFAP、S-100β的表达,Ast 进一步活化。早期<WP=6>-2- 清开灵有效组分抗大鼠局灶性脑缺血损伤的神经营养机制研究Ast 的活化在抗脑缺血损伤中发挥重要作用。同时研究发现,清开灵有效组分对 Ast 活化的影响具有相对特异性和自限性。黄芩甙、栀子甙的作用在于促进Ast 的反应性增生,而胆酸、珍珠母水解液、合方则表现为对Ast 功能活化的促进作用。其作用的自限性表现为对极早期Ast 活化的影响,随后这种效应消失。这种作用形式既促进了早期相关神经营养因子的分泌,发挥对神经元的保护作用,又自限了无限活化的反应性胶质增生及S-100β的神经毒性对受损神经元修复所造成的不利影响。 2. 清开灵有效组分可通过多途径神经营养机制发挥早期抗脑缺血损伤作用。 神经元特异性烯醇化酶(NSE)是反映脑缺血神经元损伤程度的特异性标志酶。脑缺血12h,各用药组可降低血清NSE 含量,以黄芩甙、胆酸、合方的神经保护作用最强。其抗脑缺血损伤的神经营养机制表现为:(1)促进活化的 Ast 等产生 bFGF、IL-6 是其神经营养机制的重要途径;(2)以神经元等产生 NGF、BDNF 的神经保护作用可能不是其有效机制;(3)促进神经保护蛋白 HSP70 合成,也是其发挥神经保护作用的机制之一;(4)通过TGF-β及其受体发挥神经保护作用可能不是其有效机制。 提示诱导内源性 NTFs 的表达,可能是复方中药治疗缺血神经元损伤的重要途径。此外,清开灵有效组分对受损神经元的保护作用还可能部分是通过阻抑神经元发生凋亡的过程而实现的。 3. 清开灵有效组分的生物效应具有明显的时效性和相对特异性。 时效性表现为:组分的生物效应随时间而明显增强、减弱,甚至转变。提示时间不同,机体不同机能状态引起相应靶点数量和活性的改变,同一组分中活性成分群的终末效应为其适应作用。 相对特异性表现为:清开灵有效组分对Ast 活化和对神经营养因子的不同家族、同一家族的不同成员、同一成员的因子及其受体的生物效应的差异性。提示组分中特定化学成分群作用于特定靶点群,组分的终末效应为其选择作用。如清开灵有效组分对神经生长因子家族和成纤维细胞生长因子家族作用的选择性。 4. 复方中药配伍的疗效优势可能体现在不同组分在不同环节、不同靶点生物效应的组合效应方面,因此研究中药复方要高度重视组效关系。 复方中药的生物效应是多组分在多环节、多靶点的整合作用的体现。环节