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背景博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是新发的中枢神经系统感染性病毒,它是一种未分段的有包膜的单股负链RNA病毒,与纤丝病毒科、副粘病毒科和弹状病毒科共同归属于单股负链RNA病毒目(Monnegaviradae),并针对本病毒特设Borna病毒科Borna病毒属。1895年BDV在德国博尔纳(Borna)小镇的马群中引起爆发流行,因此得名。迄今,关于BDV在自然界中的宿主、全球范围分布及传播途径等不断有了新的发现。最初认为BDV感染仅限于德国和瑞士的马群和羊群,偶见散发病例。近年来,随着更多BDV诊断技术的出现和世界各国对BDV研究的深入,已知的感染动物种类逐年增加。在自然条件下,包括鸡、山羊、兔、驴、美洲驼、羊驼、牛、狗、猫以及鸵鸟等在内的多种温血动物均可能被BDV感染。已有的研究表明人群与动物的BDV感染遍布欧洲、亚洲和美洲等多个地区,估计其实际地理分布可能更广泛。该病毒的传播途径目前仍不清楚,已知的研究发现该病毒可能随感染动物的呼吸道、结膜和粪便分泌物排出,通过鼻腔传播感染其他动物和人类。在我国,Hagiwara K、朱丹、杨爱英、徐平、赵立波、刘庆军、王振海和Chen CH等相继报道在新疆、黑龙江、重庆、宁夏、贵州及台湾的人、马和绵羊等出现BDV的自然感染,说明中国地区动物和人也存在BDV的自然感染,但在不同时间阶段动物和人的BDV自然感染情况及传播来源、传播途径等尚不清楚。目的本研究旨在前期实验的基础上,在国家高技术发展计划(863计划,2006AA02Z196)的支持下,研究中国新疆和重庆地区多物种BDV的自然感染,并分析其种系发生来源,为追查感染源、分析BDV的地理分布和阐明种内和种间传播,为部分神经精神疾病的病因学诊断及其防治提供新的思路和依据。方法1.采用前期开发的Borna病病毒荧光定量PCR诊断试剂盒,采用荧光定量套式逆转录聚合酶链反应(Fluorescence quantitative nested transcription polymerase chain reaction,FQ-nRT-PCR)检测新疆伊犁地区放养的518匹健康伊犁马和200头健康新疆驴外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的BDV p24片段,采用普通逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)来检测同样样本的BDV p40基因片段进行更深层次的验证。本实验所用BDV p24荧光定量PCR诊断试剂盒中的标准品为PMD19质粒,为了排除质粒污染的可能性,同时对所有样本进行了PMD19质粒的检测。检出阳性样本的BDV p24片段序列进入NCBI进行Blast后与GenBank中5个国家7个动物种属33例BDV p24基因序列和前期新疆地区BDV p24片段阳性的伊犁马3例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系统发生树,分析伊犁马和新疆驴中BDV可能的来源和传播途径。2.采用FQ-nRT-PCR检测重庆地区健康牛、山羊和猪各50例PBMCs中BDV p24片段,采用普通RT-PCR来检测同样样本的BDV p40基因片段进行更深层次的验证。此外为了排除质粒污染的可能性,我们对所有样本进行了PMD19质粒的检测。检出阳性样本的BDV p24片段序列进入NCBI进行Blast后与GenBank中5个国家7个动物种属33例BDV p24基因序列和前期重庆地区BDV p24片段阳性的家鸡、山羊、狗、鸽子、家兔和猪6例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系统发生树,比较在不同时间阶段BDV自然感染率有无变化;比较在不同物种不同时间阶段种系来源有无不同,从而为进一步探讨BDV的自然感染来源和传播途径打下基础。3.采用FQ-nRT-PCR检测病毒性脑炎(Viral encephalitis,VE)患者20例、非中枢神经系统感染患者52例和健康献血者18例PBMCs中BDV p24片段,采用普通RT-PCR来检测同样样本的BDV p40基因片段进行更深层次的验证。此外为了排除质粒污染的可能性,我们对所有样本进行了PMD19质粒的检测。检出阳性样本BDV p24片段序列进入NCBI进行Blast后与GenBank中5个国家7个动物种属33例BDV p24基因序列和前期重庆地区BDV p24片段阳性的精神分裂症、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、吉兰巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)和VE患者4例BDV p24基因序列进行序列和进化分析,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系统发生树,比较在不同时间阶段自然感染率有无变化;比较在不同病种不同时间阶段种系来源有无不同,从而为进一步探讨BDV的自然感染来源和传播途径打下基础。结果1.使用FQ-nRT-PCR对新疆伊犁地区动物样本RNA进行BDV p24基因片段检测。结果发现,9例样本BDV p24检测阳性(伊犁马:5/518,0.97%;新疆驴:4/200,2.00%);检出BDV p40片段阳性9例,与BDV p24阳性结果一致,其余样本均为阴性;在BDV p24和p40检测结果均为阳性的样本中未检出质粒标准品,显示所有检测样本均未发现标准品污染;9例阳性样本BDV p24基因片段的序列完全相同,与BDV标准病毒株Strain V、H1766和He/80等比对,9例阳性样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为94%～100%和82%～100%,其中与He/80株同源性最高为100%;与前期新疆地区伊犁马3例BDV p24基因序列比对,9例阳性样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为99%～100%和96%～100%;本次检测9例阳性样本和前期伊犁马3例阳性样本BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-中国新疆混合支系。2.使用FQ-nRT-PCR对重庆地区动物样本RNA进行BDV p24基因片段检测。结果发现,7例样本BDV p24检测阳性(牛:3/50,6.00%;羊:2/50,4.00%;猪:2/50,4.00%);检出BDV p40片段阳性7例,与BDV p24阳性结果一致,其余样本均为阴性;在BDV p24和p40检测结果均为阳性的样本中未检出质粒标准品,显示所有检测样本均未发现标准品污染;本次实验检测7例牛、山羊和猪阳性样本核苷酸序列和氨基酸序列完全相同,与BDV标准病毒株Strain V、H1766和He/80等比对,7例阳性样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为94%～100%和82%～100%;与前期重庆地区家鸡、山羊、狗、鸽子、家兔和猪6例BDV p24基因序列比对,同源相似性分别为94%～100%和82%～100%;本次检测7例阳性样本BDV p24片段序列和前期检测重庆地区猪的BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-中国重庆混合支系,前期检测的家鸡、山羊、狗、鸽子、家兔阳性样本BDV p24基因片段序列形成中国重庆独立支系。3.使用FQ-nRT-PCR对重庆地区人样本RNA进行BDV p24基因片段检测。结果发现,5例样本BDV p24检测阳性(VE患者:3/20,15.00%;脑血管病(Cerebrovascular disease,CVD)患者:2/32,6.25%;GBS患者、癫痫患者、多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)患者、PD患者、酒精中毒性脑病和健康献血者均为阴性);检出BDV p40片段阳性5例,与BDV p24阳性结果一致,其余样本均为阴性;在BDV p24和p40检测结果均为阳性的样本中未检出质粒标准品,显示所有检测样本均未发现标准品污染;与BDV标准病毒株Strain V、H1766和He/80等比对,本次实验检测2例VE患者和2例CVD患者样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为94%～100%和82%～100%;1例VE患者为95%～98%和89%～93%;与前期重庆地区精神分裂症、PD、GBS和VE患者4例BDV p24基因序列比对,2例VE患者和2例CVD患者样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为94%～97%和82%～89%,1例VE患者为95%～100%和93%～100%;本次检测4例阳性样本(2例CVD患者和2例VE患者)BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-中国重庆混合支系,另外1例VE患者阳性样本和前期检测的精神分裂症、PD、GBS和VE患者样本BDV p24基因片段序列形成中国重庆独立支系。结论1.中国新疆地区健康伊犁马和新疆驴存在BDV的自然感染。根据种系发生学分析其感染的BDV可能是由于该病毒在德国、瑞士、奥地利、日本和中国各国的相互传播引起。在重新构建的种系发生树分支内部,BDV在伊犁马和新疆驴存在高度的同源性,说明不同宿主之间可能存在动物和动物之间的循环传播。2.中国重庆地区健康牛、山羊和猪中存在BDV的自然感染。根据种系发生学分析,重庆地区动物宿主可能存在地源性BDV独立株和源于外来疫病病原传入的流行株。在不同物种和时期,BDV种系可能不同,可表现为某一种系为主,说明BDV及其宿主可能存在进化和变异的稳定平衡。3.中国重庆地区VE患者和CVD患者中存在BDV的自然感染。根据种系发生学分析,重庆地区人宿主可能存在地源性BDV独立株和源于外来疫病病原传入的流行株,该结论与重庆地区动物一致,不同宿主之间可能存在动物和动物、动物和人类、人类和人类之间的循环传播。