论文部分内容阅读
目的:糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropahty,DPN)是糖尿病最常见的并发症之一,并且通常认为异常脂代谢是DPN发病机制中的重要因素。SREBP-1是调节包括肝、肾、脂肪等各种组织中脂代谢特别是调节脂肪酸合成的一个关键的转录因子。PI3K/Akt通路是细胞信号转导的通路之一,在调节外周神经系统轴突包裹和髓鞘厚度方面起着重要的作用,研究表明该通路在糖尿病周围神经中被明显抑制。DPN时Akt抑制是否与SREBP-1表达降低有关,尚未明确。因此,本研究通过检测糖尿病小鼠和体外高糖环境培养的雪旺氏细胞RSC96的磷酸化的Akt及SREBP-1的表达,明确糖尿病周围神经病变时,PI3K/Akt信号通路与SREBP-1表达之间的相关关系。方法:1.建立糖尿病动物模型,免疫组织化学法和免疫蛋白印迹法检测动物坐骨神经中AKT、p-AKT和SREBP-1的表达。将16只雄性CD1小鼠随机分为正常对照组和糖尿病组两组,糖尿病小鼠模型组通过腹腔注射链脲佐菌素建立I型糖尿病模型;正常对照组注射相同体积的柠檬酸盐缓冲液。16周后深度麻醉处死小鼠,取其坐骨神经组织,通过免疫组织化学法和免疫蛋白印迹法检测AKT、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)与SREBP-1的表达;同时采用电镜观察坐骨神经髓鞘的形态学变化。2.应用高糖和胰岛素处理雪旺氏细胞,检测高糖及胰岛素作用下雪旺氏细胞AKT、p-AKT和SREBP-1的浓度变化培养的RSC96细胞分为四组正常,正常糖组、高糖组、正常糖加胰岛素组和高糖加胰岛素,给予不同刺激,培养三天后通过蛋白免疫印迹试验和免疫组织化学法检测磷酸化的AKT、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)和SREBP-1的表达。结果:1.糖尿病小鼠坐骨神经p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)表达降低并伴有异常髓鞘形成,坐骨神经中SREBP-1前体节段和成熟节段表达均明显降低正常小鼠和糖尿病小鼠喂养16周后,采用Westernblot方法检测坐骨神经中p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)表达。与正常组小鼠相比,糖尿病小鼠p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)表达明显降低(P<0.05,P<0.05),而两组的总Akt表达没明显变化(P>0.05)。相应的,同样观察到糖尿病小鼠与正常组小鼠相比,坐骨神经中SREBP-1前体节段和成熟节段表达均明显降低(P<0.05,P<0.05)。免疫组织化学法检测SREBP-1表达结果显示,糖尿病小鼠坐骨神经SREBP-1表达呈弱阳性,这与Westernblot结果一致。电镜检测结果显示:糖尿病小鼠坐骨神经中有不规则髓鞘和髓鞘折叠。2.高糖对培养的RSC96细胞PI3K/Akt信号通路和SREBP-1表达的浓度依赖效应RSC96细胞分别用不同浓度的葡萄糖(25mmol/L,50 mmol/L,100mmol/L)处理3天。结果表明,高糖刺激细胞3天后,与正常浓度的葡萄糖处理的细胞组相比,高糖处理组细胞p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)表达及成熟节段的SREBP-1明显降低,25mmol/L的葡萄糖就足以引起Akt活化的抑制和SREBP-1的表达降低(P<0.05)。免疫细胞组织化学法分别观察了正常浓度葡萄糖、高糖、甘露醇处理的RSC细胞SREBP-1的表达及其细胞定位。SREBP-1表达位于RSC96细胞的胞核和胞质。与正常浓度葡萄糖组和甘露醇组相比,高糖处理3天可引起SREBP-1表达的明显降低。3.胰岛素诱导的PI3K/Akt信号通路的激活抑制了RSC细胞长时间高糖暴露引起的SREBP-1表达的下调在无高糖的培养介质中,胰岛素刺激时细胞呈现了p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)表达轻度升高;在高糖培养介质中,胰岛素刺激后p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)表达明显升高(P<0.05,P<0.05)。而总的Akt表达没有明显变化(P>0.05)。胰岛素刺激则逆转了高糖引起的RSC细胞SREBP-1的表达降低(P<0.05)。结论:1.糖尿病时或高糖状态下,PI3K/Akt信号通路活化受抑,雪旺氏细胞SREBP-1表达降低。2.胰岛素通过激活雪旺氏细胞的PI3K/Akt信号通路,逆转高糖刺激所引起的SREBP-1表达降低。3.PI3K/Akt信号通路可能参与了糖尿病周围神经病变时雪旺氏细胞SREBP-1的表达降低。