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目的:宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤,每年全球约有50万新诊断的子宫颈癌患者,接近27万人死于子宫颈癌,因此,需要更有效的治疗宫颈癌的相关策略。人乳头瘤病毒( human papilloma virus,HPV)感染是宫颈癌的主要致病因素,整合到人染色体后,其原癌基因 E6、E7及所表达的原癌蛋白在宫颈癌的发生和发展过程中起重要的作用。目前虽然已有多种肿瘤疫苗进入临床验证,但许多疗效不尽如人意,其原因一方面是肿瘤诱导的免疫抑制,T细胞免疫功能缺陷,导致肿瘤抗原特异性 T细胞凋亡,使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控,限制了肿瘤免疫治疗效果。涉及HPV免疫识别和免疫调节的分子包括 MHC、共刺激分子 B7、粘附分子和细胞因子。其中共刺激分子 PD-L1(程序性死亡配体1)/PD-1是重要的负性信号途径,抑制肿瘤特异性 T细胞的功能,使肿瘤细胞逃避 CTL的杀伤。因而本研究运用RNA干扰技术沉默 HPV感染宫颈癌 Caski细胞的癌基因 E6/E7,将其作为肿瘤抗原与人淋巴细胞混合培养,是否能促进肿瘤特异性 T细胞增殖以及淋巴细胞的细胞毒活性,并探索其机制是否是通过阻断 PD-L1的高表达,为肿瘤的特异性免疫治疗提供新的机制和一个有希望的策略。 方法:(1)在组织水平用免疫组化染色和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测 HPV16E6/E7及PD-L1的表达情况;(2)利用RNA干扰技术设计并构建靶向 HPV16E6/E7基因的siRNA重组质粒,并将其转染宫颈癌 Caski细胞,经潮霉素筛选,通过 RT-PCR、流式细胞术检测 HPV16E6/E7基因的siRNA序列对E6/E7基因表达的沉默效果。(3)用MTT法,流式细胞术,淋巴细胞增殖实验以及CTL杀伤活性来检测沉默 E6/E7基因后 Caski细胞的生物学活性;(4)流式细胞术及RT-PCR的方法检测 E6/E7基因沉默后对 Caski细胞中PD-L1表达的影响。采用共转染法将 PD-L1的荧光报告基因转染 E6/E7基因沉默后的Caski细胞,通过测定荧光值(RLU)进一步评价 PD-L1蛋白的表达变化。 结果:(1)临床样品的组织水平:在癌症组、CIN组均有 PD-L1、HPV16E6/E7的表达,有统计学意义(P<0.01);且 PD-L1与 HPV16E6/E7之间的表达有一定的正相关性(r=0.531,P<0.01);(2)构建靶向 E6/E7基因的siRNA重组质粒,重组质粒转染 Caski细胞,经过潮霉素筛选获得稳定细胞株。RT-PCR和流式细胞术分析显示构建的两个siRNA重组质粒均可分别有效下调 E6/E7的表达;(3) MTT法检测获得的克隆细胞株 Caski-E6/E7si与阴性对照 Caski-si-ctl细胞株比较,有明显的生长抑制(P<0.05);流式细胞术检测克隆细胞株的细胞周期,结果显示 Caski-E7si细胞株与对照比较有明显的凋亡峰,其差异有统计学意义(P<0.01),而Caski-E6si与对照 Caski-si-ctl细胞株间比较,其细胞周期没有明显的变化,无统计学差异(P>0.05)。在混合淋巴细胞共培养实验中,克隆细胞株 Caski-E6/E7si均能促进淋巴细胞增殖,且两者的CTL杀伤活性要比阴性对照明显增强(P<0.05)。(4)流式细胞术和RT-PCR方法检测克隆细胞株 Caski-E6/E7si均下调 PD-L1的表达,同时下调了PD-L1的启动子活性。 结论:沉默宫颈癌 Caski细胞中HPV16E6/E7基因的表达后,与人混合淋巴细胞共培养,可以促进淋巴细胞的增殖,增加淋巴细胞 CTL的杀伤活性;同时检测宫颈癌组织及Caski细胞中免疫负向调节分子 PD-L1的表达,发现宫颈癌组织中的PD-L1的表达较对照组高,并且 HPV16E6/E7si克隆细胞株中PD-L1的表达与 Caski细胞比较有明显下调,可见宫颈癌 Caski细胞中的HPV16E6/E7可能通过 PD-L1信号通路进行免疫调节作用。为宫颈癌的免疫治疗提供了新思路及实验基础。