实验目的肥大细胞主要存在于粘膜和结缔组织中,借助于其表面表达的IgE的高亲合力受体FcεRI与抗变应原的特异性抗体IgE的交联,形成IgE/FcsRI复合物,进而引发Ⅰ型变态反应。肥大细胞胞浆中存在大量颗粒,其内储存组胺等生物介质,活化的肥大细胞也可新合成细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-13等生物介质。正是借助于这些生物活性介质,肥大细胞在变态反应性疾病过程中发挥其生物学作用。因此,肥大细胞表面受体FcsRI表达以及其生物学功能调控机制的解析将为变态反应的防治奠定理论基础。FcεRI由α-,β-和γ-链三部分构成,其中α-链是IgE特异性结合的亚基,p-和γ-链参与信号的转导。我们的前期试验结果显示转录因子Elf-1在体外可以结合到FcεRIα-链启动子的顺式元件周围的核苷酸序列。Elf-1是Ets转录因子家族成员之一,通过结合细胞核内的DNA序列,调节各种基因表达的诱导。Elf-1最初是从人类T细胞库克隆出来的一细胞型特异性转录因子,主要增强HIV-2启动子的转录。然而之后的研究发现,Elf-1在各种造血干细胞和免疫相关细胞中也可以呈现高表达,并且调控多种基因的表达,如T细胞中IL-2、GM-CSF、IL-5、IL-2RA和CD4；B细胞中免疫球蛋白重链、blk、lyn和CD1D1；巨核细胞IL-3和肥大细胞的干细胞白血病基因(SCL)。最近报道显示在人类嗜碱性粒细胞系KU812中,Elf-1还可抑制FcεRIγ-链的表达。而在FcεRIα-链启动子上具有结合位点的Elf-1是否能够影响小鼠肥大细胞FcεRI的基因表达,目前尚不可知。除转录因子外,基因表达调控还与染色体上组蛋白乙酰化的状态有关。这种状态受控于两种关键的调节因子,即组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)。曲古菌素A(TSA),是一种强效的HDAC抑制剂(HDACi),属于羟肟酸类。研究显示TSA作为一种有效的抗癌制剂,能够抑制肿瘤细胞的生长,或者诱导肿瘤细胞的分化和凋亡。另外,TSA和另一种HDACi, SAHA,还可通过调节各种基因的表达而参与了免疫性疾病,如,系统性红斑狼疮(SLE)、移植物抗宿主病、类风湿性关节炎等。尤其在变态反应的小鼠模型中,TSA还显示了其潜在治疗效应。然而,TSA是否能够影响变态反应的重要效应细胞——肥大细胞表面FcεRI的表达及其功能,目前尚未见相关报道。为此,本研究拟利用EIf-1 siRNA转染技术和体外TSA刺激等方式,探讨转录因子Elf-1和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对小鼠骨髓来源的肥大细胞(BMMC)表面FcεRI基因表达及其生物学功能的调控作用机制。进而,为肥大细胞相关的变态反应的研究提供新的实验依据。实验方法一、小鼠BMMC的制备BALB/c小鼠,雌性,6-8周龄。钝性分离小鼠双侧股骨,用1ml注射器吸取少量RPMI-1640培养液冲洗骨髓内细胞至无菌平皿中。收集液体至10ml离心管中,1000rpm,4℃离心5min,弃上清。用10m1BMMC培养液重悬细胞,移至10cm无菌培养皿,37℃培养。常规换液,培养4周待用。二、Elf-1 siRNA和Elf-1表达质粒体外转染按照Mouse Macrophage Nucleofector试剂盒说明操作,选择Y-001程序,分别将20μM Elf-1 siRNA、Control siRNA和FITC-标记的寡核苷酸经电转至小鼠1×106BMMC中,37℃分别培养24h(待试剂盒转染效率、Elf-1 mRNA表达和FcεRIα、p、γ-链mRNA表达检测)和48h(待Elf-1蛋白表达检测)。同法将1μgpGV-B2-aNN0.6或pGL3-Basic分别与25ng pRL-CMV(内参)和20μM Elf-1 siRNA/Control siRNA共同电转染至1×106BMMC中；另将5μg pGV-B2-aNN0.6或pGL3-Basic分别与25ng pRL-CMV(内参)和10μgpCR3.1-Elf-1或对照pCR3.1经Bio-Rad Gene PulserⅡ电转染至BMMC中,37℃孵育24h后,收集BMMC(待FcεRI a-链启动子荧光素酶活性的分析)。三、Elf-1表达鉴定收集24h Elf-1及Control siRNA核转染的BMMC,按照RNeasy(?) Micro试剂盒的说明,提取细胞总RNA,利用High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒反转录合成cDNA第一链,利用TaqMan Universal PCR Master Mix和7500Real-time PCR仪进行Real-time PCR,分析靶基因Elf-1 mRNA表达。Elf-1引物为(Mm00468217_ml)。另收集48h Elf-1及Control siRNA转染的BMMC,裂解细胞后,经7.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转膜1.5h后,用anti-Elf-1 Ab和anti-actinAb作为第一抗体4℃过夜孵育。洗膜后用Alexa Fluor 680 goat anti-rabbit IgG和IRDye 800 goat anti-mouse IgG分别作为抗Elf-1和actin的第二抗体进行孵育1h,洗膜后用Odyssey infrared imaging system检测Elf-1蛋白的表达。四、BMMC FcεRIα-链启动子活性检测收集转染后的BMMC,按照Dualluciferase assay试剂盒说明,经Micro LumatPlus分析FcεRIα-链启动子荧光素酶活性。五、FcεRIa-、β-和γ-链mRNA表达水平的检测收集Elf-1 siRNA/Control siRNA转染后的BMMC。利用RNeasy Micro Kit提取总RNA,利用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成cDNA第一链,利用TaqMan Universal PCR Master Mix和7500 Real-Time PCR System with TaqMan Gene Expression,进行Realtime PCR,分析靶基因α-链(Mm00438867_ml)、p-链(Mm00442780_m1)和γ-链(Mm00438869_g1)mRNA表达水平。六、PU.1结合FcεRIα-链启动子能力检测收集Elf-1 siRN A/Control siRNA转染后的BMMC,经超声破碎细胞,沉淀染色质DNA。再分别与Anti-PU.1 goat Ab和goat IgG4℃孵育1h后,经7500Realtime PCR System分析PU.1结合FcεRIα-链启动子的能力。所用引物为小鼠FcεRIα-链启动子(-82／+1)：正义链-82／-56(5’-GGCATAGCTGATGAGTTAACCAGATAC-3’),反义链+1／-22(5’-TATGGCTTCGAAAATAGGCTTGA-3’)和TaqMan probe-51/-33 (5’-FAM-CAGAAGACATTTCCTTCTC-MGB-3’)。七、TSA体外刺激BMMC调制正常小鼠BMMC浓度至1×106／ml,经0,2,10,或50 nM TSA 37℃孵育24h(待BMMC FcεRI表达和功能检测)或48h(待BMMC凋亡检测)。八、BMMC表面FcεRI表达检测收集Elf-1 siRNA/对照siRNA转染的BMMC或TSA体外刺激的BMMC,经2.42G阻断细胞表面Fc受体后,再与PE-anti FcεRIα-链抗体4℃避光孵育1h,PBS洗细胞2遍,用FACSCalibur流式细胞仪分析细胞表面FcεRI表达。九、BMMC凋亡检测收集TSA体外刺激48h的BMMC,经5μg/ml propidium iodide (PI)和Annexin V-FITC(BD Biosciences)室温染色15min后,FACSCalibur流式细胞仪分析BMMC的凋亡情况。十、肥大细胞脱颗粒能力检测收集不同浓度TSA体外刺激的BMMC,经1μg／ml IgE 4℃致敏1h,重悬于Tyrode’s缓冲液中,1×106／ml,再经1μg/ml anti-IgE37℃刺激45min后,收集上清液。加入p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucopyranoside作为底物37℃显色90min后,经酶标仪测定OD405值(ODsample)。IgE致敏细胞经2% Triton处理的培养上清液的OD值作为细胞颗粒的最大释放量(ODtotal)。IgE致敏细胞经Typrode’s缓冲液孵育的上清液的OD值为ODbase。β-氨基己糖苷酶的释放量(%)=(ODsample-ODbase) /(ODtotal-ODbase)×100%。十一、BMMC分泌合成IL-6检测TSA体外刺激的BMMC,经1μg/ml IgE/anti-IgE体外刺激1h后,提取细胞总RNA,反转录成cDNA,经Realtime PCR检测IL-6mRNA水平；经体外刺激3h或6h后,收集培养上清,按照IL-6ELISA kit说明,检测上清中IL-6分泌水平。十二、BMMC IL-6启动子上组蛋白乙酰化水平检测TSA体外刺激的BMMC,经1μg/ml IgE/anti-IgE体外刺激30min后,超声破碎细胞,沉淀染色质DNA。再与Anti-acetyl-histone H3 rabbit IgG、anti-acetyl-histone H4 rabbit antiserum或rabbit IgG4℃孵育1h后,经7500Realtime PCR System(Applied Biosystems)分析乙酰化组蛋白H3和H4结合IL-6启动子的能力。所用引物为小鼠IL-6启动子(-84／-9)：正义链IL-6-84F(5’-CCCATGAGTCTCAAAATTAGAGAGTTG-3’),反义链IL-6-9R (5’-CAGAGCAGAATGAGCTACAGACATC-3’)和TaqMan probe IL-6-56P (5’-CTCCTAATAAATATGAGACTGGG-3’)。实验结果一、siRNA干扰技术阻断小鼠BMMC Elf-1的表达1、小鼠巨噬细胞核转染试剂盒转染效果的鉴定将Nucleofector转染仪的转染程序设定为Y-001,将FITC-标记的对照寡核苷酸转染至1×106BMMC中,37℃培养24h后,BMMC经光学显微镜和荧光显微镜下观察,结果表明此试剂盒对BMMC的转染率大约可达到70%。2、转染后BMMC的Elf-1的表达将Elf-1 siRNA和Control siRNA分别转染至1×106BMMC中,37℃培养24h后,Elf-1 mRNA的表达经Real-time PCR检测,结果显示Elf-1 siRNA转染的BMMC的Elf-1 mRNA表达量不足Control siRNA转染的BMMC的Elf-1mRNA表达量的1／5。转染48h后,经Western blot检测,Elf-1 siRNA转染的BMMC的Elf-1蛋白表达显著低于Control siRNA转染的BMMC的Elf-1蛋白表达,由此表明Elf-1 siRNA特异性地抑制BMMC Elf-1的转录和蛋白表达。二、Elf-1对小鼠BMMC FcεRI基因表达调控的研究1、Elf-1对小鼠BMMC FcεRIα-链启动子活性的影响将携带受控于FcεRI a-链启动子(-605／+29)的荧光素酶的报告质粒pGV-B2-aNN0.6或对照质粒pGL3-Basic分别与Elf-1 siRNA/Control siRNA转染至BMMC之后,检测小鼠BMMC FcεRIα-链启动子活性。结果显示,Elf-1siRNA/pGL3-Basic共转染和Control siRNA/pGL3-Basic共转染的BMMC FcεRIα-链启动子活性均较低,而Elf-1 siRNA/pGV-B2-aNN0.6共转染的BMMC FcεRIα-链启动子活性却显著高于Control siRNA/pGV-B2-aNN0.6共转染组,这表明Elf-1的表达下降能够增强BMMC FcεRI a-链启动子的转录活性。相一致的是,Elf-1的过表达显著降低BMMC FcεRI a-链启动子的转录活性。由此提示,Elf-1对BMMCFcεRI a-链启动子活性具有抑制作用。2、Elf-1对小鼠BMMC FcεRIα、β、γ-链mRNA表达的影响Elf-1 siRNA/Control siRNA转染至BMMC,24h之后,Real-time PCR检测小鼠BMMC FcεRIα、β、γ-链mRNA的表达。结果显示,Elf-1 siRNA转染的BMMC FcεRI a-链mRNA表达水平显著高于Control siRNA转染的BMMC,而FcεRIβ和γ-链mRNA的表达水平两组未见显著性差异。由此提示,Elf-1能够抑制BMMCFcεRIα-链的转录水平。3、Elf-1对转录因子PU.1向小鼠BMMC FcεRI a-链启动子募集的影响Elf-1 siRNA/Control siRNA转染至BMMC,24h之后收集BMMC。经CHIPassay结果显示, Elf-1 siRNA转染的BMMC中与PU.1结合的FcεRI a-链启动子的量显著高于Control siRNA转染的BMMC,由此提示,Elf-1抑制了另一转录因子PU.1向BMMC FcεRIα-链启动子的募集。4、Elf-1对小鼠BMMC表面FcεRI表达的影响Elf-1 siRNA/Control siRNA转染至BMMC,48h之后收集BMMC。经FACS检测,结果显示,Elf-1 siRNA转染的BMMC表达FcεRI的量与Control siRNA转染的BMMC相似。由此提示,Elf-1未影响BMMC表面FcεRI的表达。三、TSA对小鼠BMMC活化的影响1、TSA对小鼠BMMC脱颗粒的影响小鼠BMMC分别经0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育24h后,经1μg／mlIgE/anti-IgE体外刺激,并检测细胞释放β-氨基己糖苷酶的量。结果显示,未经TSA孵育的BMMC的β-氨基己糖苷酶的释放可达到50.44+1.63%,TSA孵育后,BMMCβ-氨基己糖苷酶的释放以剂量依赖方式被抑制。2、TSA对小鼠BMMC产生IL-6的影响小鼠BMMC分别经0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育24h后,经1μg／mlIgE/anti-IgE体外刺激1h,收集BMMC, Real-time PCR检测IL-6 mRNA的产生。结果显示,TSA以剂量依赖方式抑制小鼠FcεRI介导活化的BMMC IL-6 mRNA的合成。经1μg/ml IgE/anti-IgE体外刺激6h,收集BMMC培养上清,经ELISA方法检测IL-6的分泌情况,结果同样显示TSA以剂量依赖方式抑制小鼠FcsRI介导活化的BMMC IL-6的分泌。3、TSA对小鼠BMMC FcεRI表达的影响小鼠BMMC分别经0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育24h后,经FACS检测细胞表面FcεRI的表达。结果显示,与未经TSA孵育的BMMC相比,50nM TSA孵育后的BMMC FcεRI表达降低,而2nM和10nM TSA孵育后的BMMC FcεRI表达没有明显变化。4、TSA对小鼠BMMC凋亡的影响小鼠BMMC分别经0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育48h后,经FACS检测细胞的凋亡情况。结果显示,与未经TSA孵育的BMMC相比,50nM TSA孵育后Annexin V-FITC+/PI细胞即凋亡细胞明显增加,而2nM和10nM TSA孵育后凋亡细胞数未见明显变化。5、TSA对小鼠BMMC IL-6启动子组蛋白乙酰化的影响小鼠BMMC分别经0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育24h后,经1μg／mlIgE/anti-IgE体外刺激0.5h,收集BMMC,沉淀DNA, CHIP assay检测结果显示,与未经TSA孵育的BMMC相比,10nM和50nM TSA均能增强小鼠FcεRI介导活化的BMMC IL-6启动子组蛋白H3和H4乙酰化的水平。结论1、小鼠巨噬细胞核转染试剂盒(Amaxa)同样适用于小鼠BMMC的核酸转染。2、Elf-1 siRNA可特异性降低小鼠BMMC的Elf-1表达。3、Elf-1通过抑制PU.1与α-链启动子之间的结合,抑制小鼠BMMC FcεRI a-链启动子的活性和转录。4、Elf-1可抑制小鼠BMMC FcεRIa-链mRNA的表达,但对β-和γ-链的转录未见有意义的影响。5、Elf-1单独作用尚不能影响小鼠BMMC FcεRI的表面表达。6、TSA以剂量依赖方式抑制FcεRI-介导的BMMC活化。7、50nM TSA通过诱导细胞凋亡降低小鼠BMMC FcεRI的表达,抑制FcεRI-介导的BMMC脱颗粒和IL-6合成分泌。8、TSA增强小鼠FcεRI介导活化的BMMC IL-6启动子组蛋白乙酰化的水平。