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1.研究背景：胰腺癌为恶性程度最高的消化道肿瘤,每年因罹患胰腺癌而致死亡的患者人数在肿瘤致死患者数中位列第四,胰腺癌患者的5年生存率<5%。少于20%的胰腺癌患者可接受根治性手术治疗,因此化疗是目前胰腺癌治疗的最主要方法。但即使是吉西他滨单药化疗这一数十年来最为行之有效的胰腺癌标准保守疗法,肿瘤反应率也仅有10%,而患者生存相关指标也仅得到了轻微改善(约6个月)传统化疗方法不仅疗效欠佳同时对正常组织的有较大的毒副作用,由此,研发新的治疗策略克服胰腺癌高度化疗耐药是急需解决的难题。肿瘤血管生成被认为是大多数肿瘤发生及进展的必要条件,同时,不具备正常形态与功能的肿瘤血管又可极大的影响化疗药物转运及疗效。2009年Olive等发表于Science的研究报道指出,血管生成并非是胰腺癌发生发展的前提,而肿瘤血管灌注改善可带来化疗药物在胰腺癌内的转运增加,这不仅解释了胰腺癌耐受抗血管疗法的原因,也指出了胰腺癌高度化疗耐药的重要机制。Notch通路可直接调节细胞分化、增殖与凋亡等生物学行为,近来的研究显示Notch通路在调控血管生成的同时也对肿瘤进展发挥着重要作用,而Notch通路各基因在胰腺癌中的高表达可能成为一个潜在的治疗靶点。Dll4作为VEGF下游的负性调控因子,是Notch通路中对血管生成发挥决定性调节作用的配体,研究显示D114的表达并不仅限于血管内皮细胞,在多种肿瘤细胞的胞浆及胞核中也观察到了D114的异常表达；更重要的是,已有研究发现D114在肿瘤细胞的异常表达与NF-kB活性及肿瘤干细胞等直接相关；同时,研究发现Notch通路在胰腺癌细胞中的激活是依赖于配体的,而D114却在胰腺癌细胞中出现了不均一的高表达。这些研究提示D114/Notch通路在肿瘤进展中可能发挥着重要的调节作用。在本实验中我们首先利用Real-time PCR及Western-Blot技术研究了D114/Notch在胰腺癌临床标本中的mRNA及蛋白表达情况,并发现D114及其主要受体(Notch 1/4)出现了程度不等的表达升高；随后,在胰腺癌细胞系中进一步研究D114/Notch异常激活对胰腺癌细胞系化疗耐药等生物学行为的影响；最后,在体内实验中探讨了D114/Notch通路对胰腺癌化疗药物转运产生的影响。2.试验方法：2.1 D114及其主要受体(Notch 1/4)在胰腺癌标本中的表达：Real-timePCR及免疫组化在42例胰腺癌临床标本中分别检测了D114/Notch1/Notch4的mRNA或蛋白表达水平；2.2构建D114-pc DNA3.1载体并建立D114稳转胰腺癌细胞系：为了进一步研究在临床标本中出现的D114/Notch高表达是否对胰腺癌的高度化疗耐药特性等生物学行为产生影响,我们构建了D114-pc DNA3.1载体,并通过脂质体转染建立了D114稳定表达的胰腺癌细胞系；2.3过度激活D114/Notch通路对胰腺癌细胞系生物学行为的影响：我们通过CCK-8、MTT法、软琼脂克隆形成等方法分别检测了D114/Notch对胰腺癌细胞系增殖、化疗耐药性及停泊非依赖性生长的影响.并通过Real-time PCR初步研究了可能参与D114/Notch通路影响胰腺癌细胞系化疗耐药性的机制；2.4过度激活D114/Notch通路对胰腺癌细胞系促血管生成相关功能影响的体外实验研究：将D114稳转细胞系(1/2.5×105)种于六孔板中培养36h后检测上清液中VEGF含量,并通过Real-time PCR检测相关基因表达变化；2.5体内试验研究D114/Notch对胰腺癌血液灌注及化疗药物转运的影响：在荷瘤鼠体内通过DCE-MRI.荧光与DOX灌注,并利用激光共聚焦显微镜观察研究了肿瘤血液灌注与化疗药物转运的改变：2.6体内试验研究D114/Notch对胰腺癌化疗耐药性的影响：将稳定转染D114-pcDNA3.1或空载体的胰腺癌细胞系注射于裸鼠皮下成瘤,对两组荷瘤鼠给于吉西他滨化疗,通过测量瘤体大小并通过Tumor=a×b2/2计算肿瘤体积,研究D114/Notch对胰腺癌化疗耐药性的影响。3.试验结果：3.1 D114/Notchl/Notch4表达水平出现程度不等的升高：通过免疫组化试验发现D114在大多数胰腺癌组织的肿瘤细胞出现了程度不一的表达量升高,而且表达阳性率具有统计学意义,通过Real-time PCR可见D114/Notch1/Notch4 mRNA表达水平在部分胰腺癌组织升高；3.2成功构建D114-pcDNA3.1载体及稳转胰腺癌细胞系：从人胎盘组织扩增人D114全长,利用分子克隆方法构建D114-pcDNA3.1(+)质粒并经测序鉴定无误,随后通过脂质体转染目的载体或空载体,利用G418筛选构建稳转细胞系,并通过Real-time PCR及Western-blot验证；3.3过度激活D114/Notch通路对胰腺癌细胞系的影响：D114/Notch通路不影响胰腺癌细胞克隆形成能力,但明显减缓细胞体外增殖速度,并可增强早期胰腺癌多药化疗耐药性,通过Real-time PCR发现DV(D114 vector)载体稳转细胞系中的肿瘤干细胞相关基因(Oct4/Nanog)、EMT相关基因(snail/Vimentin/ZEB)及NF-kB靶基因(MMP-9)表达均出现升高,提示这些关键的化疗耐药相关机制参与了D114/Notch增强胰腺癌化疗耐药的过程；3.4 DI14在体外对胰腺癌细胞系促血管生成能力无明显影响：稳转胰腺癌细胞系VEGF分泌量无显著下降,Real-time PCR发现D114稳定转染胰腺癌细胞系VEGF mRNA表达量无明显改变；3.5 D114/Notch过度激活可减少胰腺癌组织血液灌注并降低化疗药物灌注：皮下注射构建EV(empty vector)及DV(D114 vector)组荷瘤鼠模型,通过DCE-MRI及荧光灌注检查发现DV组胰腺癌肿瘤血管生成减少、血液灌注降低,随后通过Dox灌注发现DV组胰腺癌化疗药物转运也出现了减少；3.6体内试验证实D114/Notch通路过度激活可增强胰腺癌化疗耐药性：每周两次测量移植瘤模型大小变化,并给以吉西他滨(100mg/kg)化疗,试验结果显示EV组肿瘤生长速度较DV组明显减缓,提示吉西他滨化疗对DV敏感性下降。4.研究结论：4.1 D114及其主要受体(Notch1/4)在部分胰腺癌肿瘤出现了高表达,其中D114的蛋白阳性表达率具有统计学意义；4.2 D114/Notch通路的过度激活可能通过促进肿瘤干细胞、EMT等途径增强胰腺癌的多药化疗耐药性；4.3 D114/Notch通路过度激活可以降低胰腺癌有效灌注,并减少化疗药物的有效转运。