论文部分内容阅读
目的：1.分析慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)及肝脏组织T淋巴细胞受体(T cell receptor, TCR)β链各家族互补决定区3(complementarity determining region3,CDR3)谱系的变化,比较CHB患者PBMC及肝脏组织TCRBV家族CDR3克隆增生异常率；2.初步探讨肝脏组织病理学改变及血清HBVDNA载量与TCRCDR3谱系漂移的关系；3.对出现的单或寡克隆性增生T细胞TCRCDR3区进行基因和氨基酸组成分析,为CHB患者的个体化治疗寻找共同的特异性(Hepatitis B virus, HBV)抗原表位奠定基础。方法：1.采集4例正常献血员抗凝静脉血5mL、11例CHB患者外周抗凝静脉血5mL及相应肝组织为研究对象。密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),提取PBMC及肝组织总RNA,逆转录合成cDNA,根据TCRβ链24个可变区基因片段(BV)家族设计相应的上游特异性引物,在恒定区(BC)设计一条共用的荧光标记的下游引物,采用荧光定量PCR (fluorescence quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)溶解曲线法扩增出包含完整的CDR3区的24个TCRBV家族,继而分析各样本PCR产物形成的24个TCRBV家族溶解曲线谱型图；2.选取谱型图上呈单／寡峰形的TCRBV家族PCR产物相同条件进行PCR,经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行基因测序,利用分子生物信息学软件DNAtools6.0等分析C D R 3区的基因和氨基酸组成；3.比较11例CHB患者外周血及肝组织TRBV各家族CDR3克隆增生异常率,同时对11例CHB患者PBMC及肝组织TRBV家族CDR3克隆增生异常率与HBV-DNA载量、肝组织学炎症分级、纤维化分期分别做Spearman’s相关分析。结果：1.4例正常人外周血TCRβ链24个家族CDR3谱型图大多数呈多峰形,即各家族呈现不同的CDR3多态性,其24个家族逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳时均发现一条模糊条带。11例CHB患者PBMC及肝组织TCRβ链各家族CDR3溶解曲线谱型图出现数量不等,形态不一的单峰、寡峰、偏峰,部分家族表达频率极低或缺失,在1.5%琼脂糖凝胶电泳图上多数家族预测范围大小处呈现一条模糊条带,部分家族出现清晰条带或无条带；2.肝组织TRBV家族的克隆增生异常率显著高于外周血的异常率(X2=18.50,P<0.01)；3.11例CHB患者PBMC TRBV家族CDR3克隆增生异常率与HBV-DNA载量、肝组织学炎症分级、纤维化分期做Spearman’s相关分析,显示上述各项指标与CHB患者PBMCTRBV家族CDR3克隆增生异常率无相关性；4.11例CHB患者肝组织TRBV家族CDR3克隆增生异常率与HBV-DNA载量、肝组织学炎症分级、纤维化分期采用Spearman’s相关分析发现CHB患者肝组织TRBV家族CDR3克隆增生异常率与炎症分级呈负相关,相关系数r=-0.65,P<0.05；其他各项无相关性；5.对谱型图上呈单/寡克隆性增生的部分家族进行TCRCDR3区测序发现,患者2外周血TRBV10与其肝组织TRBV8、TRBV11有完全相同CDR3序列；外周血中的患者2TRBV10、患者4TRBV11,肝组织中的患者2TRBV8、患者4TRBV11有相同基序" T D T Q Y";外周血中的患者3TRBV19、TRBV20,肝组织中患者6TRBV11有相同基序"Q P Q H "。结论：1.CHB患者炎症活动期外周血和肝组织多个TCRBV家族谱型存在克隆性增生,且绝大部分单/寡克隆性增生的T细胞不具有相同的CDR3氨基酸序列,提示慢性乙型肝炎炎症活动期多个抗原表位参与了T细胞免疫应答。2.CHB患者炎症活动期肝组织免疫应答较外周血细胞免疫应答有明显差异。3.其中一例患者在外周血及肝组织中不同TRBV家族有完全相同TCRCDR3区,推测为该个体针对同一HBV抗原表位的T细胞克隆应答,为CHB患者的T细胞应答机制和个体化治疗、HBV的T细胞表位研究提供了初步的基础。