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研究背景 掌跖角化病（Palmoplanter keratoderma,PPK）又称掌跖角皮病,是掌跖部皮肤异常增厚、角化过度为特点的一类慢性皮肤病。临床上,根据有无家族史,可将其分为遗传性和获得性。前者可表现为显性、隐性或X连锁遗传;根据组织病理学特征,将其分为表皮松解型、非表皮松解型、汗孔角化型掌跖角化病;根据皮损形态将其分为弥漫性、局灶性、条纹状、点状掌跖角化病。点状掌跖角化病（Punctate palmoplanter keratoderma,PPPK）,人类孟德尔遗传在线（Online Mendelian inheritance in Man database,OMIM）编号 148600,是一种以掌跖部不规则分布、进行性加重的角化性丘疹为特征的常染色体显性遗传性皮肤病。PPPK影响患者身心健康和生活质量,目前尚无有效根治方法。探索PPPK发病规律、寻找PPPK致病基因是现阶段该病研究热点。对于致病基因明确的单基因病,对已知致病基因进行直接测序就可以找到致病突变位点。截止目前,已报道38个α/γ-衔接蛋白结合蛋白（Alpha-and gamma-adaptin binding Protein,AAGAB）基因突变位点和 1 个 XIV 型胶原纤维 α1链基因(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain,COL14A1乃突变位点与PPPK发病有关,其中COL14A1基因突变致病性尚有待于进一步蛋白质功能学研究证实和候选基因重复性验证。此外,仍有部分报道中国汉族人PPPK家系未发现上述相关致病突变位点。这说明PPPK可能存在遗传异质性,即该病除上述致病基因之外,可能还存在其他致病基因。人类外显子组序列仅占人类整个基因组1%,在已发现的人类单基因遗传病中,约85%致病突变都位于这1%的蛋白质编码序列。对于有遗传异质性或致病基因不明的单基因病,全外显子组测序是目前寻找其致病基因的最有效手段。目的（1）分析一个中国汉族人点状掌跖角化病家系临床表型及遗传学特征;（2）寻找其致病基因,提供疾病及遗传咨询。方法（1）收集来自安徽省铜陵市一个汉族人PPPK家系。通过家系调查,分析其临床表型及遗传学特征。同时,家系采集小组抽取第二、第三代所有家系成员静脉血各4ml抗凝处理后,超低温冰箱保存。（2）提取基因组DNA;设计AAGAB基因10个外显子10对引物;聚合酶链反应（PCR）扩增家系患者AAGAB基因10个外显子及其侧翼序列,对扩增产物进行直接测序。（3）若该家系患者AAGAB基因编码区未发现致病突变位点,进一步采用全外显子组测序技术寻找该家系致病基因:①选取家系内临床表型显著且严重程度相近2名患者（Ⅱ2和Ⅱ5）外周静脉血,提取基因组DNA;②将基因组DNA随机打断、末端修复、连接,制备线性文库;③制备成杂交文库;④基因组DNA全外显子组捕获、富集,对富集后片段进行PCR扩增;⑤PCR产物进行高通量测序;⑥使用Il1umina碱基识别软件读取原始图像文件;⑦使用Burrows-Whee1erAligner软件与人类参考基因组（GRCh37/HG19）进行比对;⑧使用 GATK（v3.3.0）HaplotypeCaller 软件识别基因组单核苷酸变异（Single nucleotide varians,SNVs）和插入缺失（Insertion and Deletions,InDels）变异;⑨通过与dbSNP库、1000 Genomes及病例共有等方式进行比对,过滤掉常见SNVs和InDels（去除dbSNP库、1000 Genomes等数据库中次等位频率>=1%SNVs/InDels）;同时鉴别SNVs和InDels是否导致蛋白编码发生变化和氨基酸发生改变;或者编码区非同义突变SNVs的SIFT（Sorting Intolerant From Tolerant）值是否小于 0.05,或者 Polyphen（Polymorphism Phenotyping）软件预测氨基酸改变对蛋白质生物学功能的影响是否有害。（4）选取2名患者共有、与皮肤代谢有关的罕见或新发变异位点为该家系候选突变位点。对全外显子组测序鉴定出的候选突变位点,设计引物;分别对家系内另外3例患者和第二、三代正常成员及120名50岁以上来我院健康体检的正常人基因组DNA目标位点及上下游区域进行PCR扩增;PCR产物纯化后,DNA测序;将测序结果在家系内进行基因型-表型共分离分析。结果（1）临床表型特征:该家系PPPK患者均在25岁左右发病;起初皮疹表现为针头大小、淡黄色、半透明的角化性丘疹,随年龄增长,皮疹数量多、体积增大,严重者角化性丘疹融合成斑块,以掌跖着力处最为显著;双足跖处皮损明显重于双手掌;双手掌心和双足弓内侧等非着力处皮损较轻或缺如;第二代患者皮损明显重于第三代;同辈患者中,劳动强度大者,皮损症状重。（2）该家系4代,共34人,患者6例,其中男性3例,女性3例,连续3代均有发病,符合常染色体显性遗传模式。（3）该家系患者AAGAB基因10个外显子及其侧翼序列未发现致病突变位点及单核苷酸多态性位点。（4）全外显子组测序结果显示,样品Ⅱ2平均测序深度137.51,覆盖度99.79%,测序深度≥20x目标区域的覆盖度97.89%;样品Ⅱ5平均测序深度148.03,覆盖度99.71%,测序深度≥20x目标区域的覆盖度97.76%。经过数据过滤和比对,筛选出两者共有的位于编码区和剪切位点的罕见和新发SNVs和InDels变异数分别为40和60个。对以上100个变异位点进行蛋白质表达、功能及致病性进行具体分析。其中与皮肤代谢有关的3个罕见及新发变异位点及对应基因名称分别为FLG基因（NM002016.1:c.13331334insCCCA →p.Leu445Arg446）、HRNR基因（M001009931.2:c.82928293insCT→p.Ala2764Gly2765）、CELA1基因（NM001971,5:c.419delC→р.Ala140Val）。Sanger法DNA测序证实该家系内患者携带糜蛋白酶样弹力蛋白酶 1（Chymo-trypsin like elastase family member 1,CLA1）基因第 5 外显子с.419delC杂合移码突变,正常家系成员及120名正常人均不携带该突变,符合基因型与表型共分离。结论（1）本研究PPPK家系患者皮损严重程度与后天因素尤其是掌跖部位长期摩擦、刺激、受力等有关。（2）本研究家系遗传方式符合常染色体显性遗传。（3）本研究家系PPPK发病与AAGAB基因编码区突变无关联;PPPK存在其他致病基因。（4）CELA1基因c.419delC杂合移码突变可能是本研究家系致病变异位点。