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花生(Arachis hypogaea L.)是重要的油料作物。由于种质资源的局限及缺乏对重要病、虫、草害的抗性,限制了常规育种在花生抗性育种中的作用。
脱落酸(ABA)作为一种胁迫信号转导物质,在植物对水分胁迫的适应性反应中起着重要作用。在生物和非生物胁迫条件下,植物体内的ABA含量增加,这种效应主要是通过激活ABA合成及抑制其降解来实现,外加ABA能显著提高作物的抗旱性。
9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是调节ABA生物合成的关键限速酶,过量表达NCED基因能够提高转基因植物对胁迫条件的抗性。NCED基因的研究大多集中在拟南芥、豇豆、玉米等植物中,花生NCED基因的研究缺乏。本实验室于2005年从粤油7号叶片中克隆出一个NCDE基因(命名为AhNCEDl基因),经证明,该基因受干旱诱导表达,是花生抗旱基因。
本论文以干旱敏感品种汕油523为实验材料,以上胚轴为外植体,旨在研究细胞分裂素(BA和4-PU)对花生再生体系的影响;建立和优化农杆菌介导的花生AhNCEDl基因遗传转化体系,主要获得了以下结果:
1、以花生上胚轴为外植体,当4-PU浓度为0.1mg/L,BA浓度为4mg/L时出愈率为100%;不定芽器官发生再生途径的适宜培养基分别为:丛生芽培养基:MS+0.1mg/L 4-PU+2mg/L BA;伸长培养基:MS+0.1mg/L 4-PU+4mg/L BA2、构建了带有35S启动子、以GUS为报告基因、NPTⅡ基因为抗性筛选基因、含有AhNCED1基因的过表达载体,并转化农杆菌LBA4404。
3、对影响根癌农杆菌转化主要因素的研究结果表明:预培养0d,菌液浓度OD600为0.8,浸染时间5-6min,GUS瞬时表达率和抗性芽发生率为100%,抗性芽数平均存活最高为1.67个。基因枪轰击法转化花生(粤油7)愈伤组织获得最大抗性芽率为3.2%。
4、从获得的抗性植株中随机抽89株,经PCR检测阳性率为48.3%;其中50%GUS组织化学染色呈阳性。
5.4株转基因花生(地上部分)内源ABA含量比野生型植株分别高5.94、2.66、2.40、1.20和1.40倍。
本研究结果初步证实了AhNCED1基因已整合汕油523基因组中,为进一步认识该基因在花生ABA合成及抗旱中的作用奠定了基础。