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背景:猪圆环病毒疾病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)给全世界养猪业带来了巨大的经济损失,是养猪业三大传染病之一,它的主要病原体是猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)。PCV2衣壳蛋白由PCV2的开放阅读框2(Open reading frame 2,ORF2)编码,是 PCV2 的主要免疫成分。目的:研发以衣壳蛋白为抗原的PCV2亚单位疫苗。内容:(1)构建大肠杆菌表达系统,表达衣壳蛋白;(2)分离纯化得到重组衣壳蛋白;(3)通过戊二醛交联法将h-BN纳米颗粒与衣壳蛋白偶联,通过各种方法检测偶联是否成功;(4)制作偶联产物及各种佐剂疫苗,免疫小鼠,检测抗体效价与细胞因子浓度。结果:本文构建了 ORF2的重组表达细菌(BL21(DE3)—pGEX-ORF2),诱导表达后,经过SDS—PAGE验证,目的蛋白没有表达。ORF2的N端有连续的稀有密码子,导致了其不能在大肠杆菌表达系统内表达。由于重组蛋白的N端与C端均带有组氨酸标签,故采用镍离子亲和层析分离纯化目的蛋白。扩大培养表达细菌(BL21(DE3)—pET32a—ORF2),超声波破碎细菌,离心收集上清液。将上清液通过镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,经过SDS—PAGE检测,得到纯度较高的目的蛋白。通过XPS、SEM、TEM、FTIR技术对h-BN纳米颗粒进行表征,知道了 h-BN是直径30-60nm的圆盘状粒子。通过激光纳米粒度仪检测h-BN分散在水中时的Zeta电位为-30mV,表明h-BN在水中分散均匀能够稳定存在。h-BN纳米颗粒表面氨基化处理后,h-BN与BSA通过戊二醛偶联,紫外可见分光度计、扫描电镜检测h-BN与BSA已成功偶联,成功制备了偶联产物BSA@BN。检测h-BN的载药量为19%,即1mg h-BN偶联0.19mgBSA。将BSA@BN置于不同pH的缓冲液中,在不同时间点取出,离心收集上清,检测蛋白释放情况。发现在BSA@BN在酸性或中性环境时,蛋白释放到溶液较少;而在碱性时,蛋白释放较多。成功制备了氢氧化铝佐剂疫苗、白油佐剂疫苗、金纳米颗粒疫苗、BN佐剂疫苗(h-BN与衣壳蛋白的偶联产物)并用这些疫苗两次免疫SPF级的ICR小鼠。收集小鼠血清,利用ELISA技术检测血清中抗体效价与IFN-γ的浓度。结果表明BN佐剂疫苗刺激小鼠产生了很好的免疫效果。结论:本课题首次将h-BN纳米颗粒应用于猪圆环病毒亚单位疫苗的研究,成功制备了 BN佐剂疫苗,具有显著的免疫效果。