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目的:(1)研究miR-183在肝细胞癌(HCC)中的重要作用。(2)构建miR-34a及miR-424人工miRNA表达簇,分析表达簇对肝癌细胞周期进程的影响,并对miRNA的加工对携带miRNA宿主基因蛋白表达水平的影响进行初步研究。方法:(1)为研究miR-183在HCC中的重要作用,比较了HCC肿瘤组织和癌旁组织的miR-183表达,运用生物信息学技术预测了miR-183的候选靶基因,运用荧光素酶报告基因、western blot和qRT-PCR等技术对候选靶基因进行验证,根据靶基因的功能特点深入分析miR-183在肝癌细胞中的作用。用DAPI细胞染色和Annexin-V分析肝癌细胞凋亡,DAPI染色依据细胞核形态变化判断细胞凋亡。(2)从miRNA表达库中扩增miR-34a及miR-424的前体序列,将上述两种miRNA串联,构建PGL-34a-424人工miRNA簇表达载体。通过RT-PCR的方法检测人工miRNA簇的表达情况。然后将miRNA前体突变,运用荧光素酶报告基因技术研究miRNA的加工对携带miRNA宿主基因蛋白表达的影响。此外我们构建了pEGFP-34a-424表达载体,分析人工miRNA簇对肝癌细胞的周期阻滞情况。结果:(1) qRT-PCR方法检测多组HCC肿瘤组织及其癌旁组织中miR-183的表达,结果显示68%的肿瘤组织中miR-183的表达显著上调(2~300倍)。运用TargetScan生物信息学工具预测miR-183潜在的靶基因,荧光素酶报告基因技术证实PDCD4是miR-183直接作用的靶,western blot和qRT-PCR结果表明miR-183能够下调PDCD4的mRNA及蛋白水平的表达。PDCD4是TGF-β1诱导的肝癌细胞凋亡通路上的重要分子,在HCC中表达下调,DAPI细胞染色和Annexin-V分析均显示转染miR-183后TGF-β1诱导的肝癌细胞凋亡数显著减少。(2)成功构建人工miRNA簇表达载体,串联的miR-34a和miR-424均可获得表达。荧光素酶实验结果表明miRNA的加工对携带miRNA宿主基因蛋白的表达有显著的影响。此外转染人工miRNA簇pEGFP-34a-424的肝癌细胞G0/G1的细胞数目(90.15%)较pEGFP-34a (84.44%)和pEGFP-424(85.84%)增多。结论:(1) miR-183在多数HCC组织中表达上调,miR-183通过下调抑癌基因PDCD4的表达抑制TGF-β1诱导的肝癌细胞凋亡。因此,miR-183可能在HCC的发生发展中发挥重要作用。(2)人工miRNA表达簇能够高效表达成熟的miRNA, miRNA的加工对携带miRNA宿主基因蛋白的表达有抑制作用。人工miRNA簇抑制肿瘤细胞周期的效果强于单个miRNA。