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目的:HPV18 E6癌蛋白与宫颈癌发生、发展密切相关。应用酵母双杂交系统,构建HPV18E6癌蛋白诱饵质粒,在Hela细胞cDNA文库中筛选与HPV18 E6癌基因直接相互结合蛋白,并对TMEM 87B进行生物信息学分析,探讨HPV18 E6和vimentin直接相互作用在顺铂诱导宫颈癌细胞衰老中的功能效应。方法:1.应用RT PCR扩增HPV18E6基因cDNA开放阅读框基因片段后与pGBKT7载体定向重组,通过酶切测序鉴定重组质粒;醋酸锂法将pGBKT7-HPV18 E6重组质粒转化AH109酵母菌株,缺陷性培养基上观察AH109生长情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活效应。2.将成功构建的pGBKT7-HPV18E6重组质粒醋酸锂法转化感受态酵母菌AH109,随后转化Hela MATCHMAKER cDNA文库质粒,筛选阳性克隆。提取酵母质粒纯化后电转感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性质粒,排除假阳性和重复插入片段后酶切电泳、测序后行基因序列分析宫颈癌HPV18 E6直接相互作用蛋白。3.应用因特网资源,运用BLAST、ProtParam tool、The ELM Server及InterProScan等数据库或在线软件对TMEM 87B基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,预测其基因结构、染色体定位、编码蛋白质理化性质、亚细胞定位、蛋白质功能域等信息,并对多物种中的相似性蛋白进行了系统进化分析。4.酵母体内和体外Co-IP法验证HPV18 E6和vimentin直接相互作用;免疫组化法检测HPV18 E6和vimentin蛋白及CBX3蛋白在人宫颈癌切片中的表达情况。应用不同浓度梯度顺铂作用Hela细胞,选择最佳诱导衰老而无明显凋亡发生的实验浓度。检测Hela细胞衰老过程中HPV18 E6和vimentin以及P53、P21、CDC2等衰老相关调控基因表达变化;应用SA-βG al(衰老相关β-半乳糖苷酶)染色法检测通过脂质体法单独转染或共转染siRNA-HPV18 E6和siRNA-vimentin时顺铂诱导肿瘤细胞衰老敏感性变化情况;PI单染流式细胞仪检测细胞周期变化;Western blot检测P53、P21、CDC2等衰老相关调控基因表达变化情况;建立顺铂诱导宫颈癌肿瘤细胞衰老动物模型;分析衰老动物模型中HPV18 E6和vimentin表达变化。结果:1.成功构建重组质粒pGBKT7-HPV18 E6,转化重组质粒pGBKT7-HPV18 E6和pGBKT7空载体的酵母菌在YPDA液体培养基中培养16h后,菌液的A600nm值分别为0.98和0.99;两种酵母菌均在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-gal,SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上不能生长,pGBKT7-HPV18E6转化酵母菌AH109与pGADT7-T转化酵母菌Y187交配后二倍体在SD/-Trp/-Leu培养盘中能长出白色克隆,而在SD/-His/-Trp/-Leu/X-α-gal及SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu/X-α-gal盘中均无克隆生长,说明重组质粒pGBKT7-HPV18E6对酵母菌AH109无毒性且不具自主激活报告基因效应。2.该诱饵载体应用于在Hela细胞cDNA文库中筛选与HPV18E6相互作用的蛋白质,随机挑取50个克隆进行电转后,双酶切后电泳,测序鉴定7种与HPV18E6直接相互作用蛋白:跨膜蛋白87B、膦甲酸免疫相关蛋白5、波形蛋白Vimentin、KM-HN-1蛋白、无功能糖基转移酶样蛋白7、痘苗相关激酶蛋白2以及一种未知蛋白。3.对获得的7种阳性蛋白进行初步生物信息学分析确定其生物功能,对TMEM 87B蛋白进行进一步分析,发现TMEM87B是一种6次跨膜的分泌性蛋白,有众多磷酸化位点和功能基序,在多物种间有高度保守序列,与肿瘤生成信号转导和转录调控相关;4.免疫组化结果显示CBX3在CIN和宫颈癌早期表达达高峰,而HPV18 E6和vimentin在宫颈癌早期呈高表达。在一定小剂量顺铂(3.300μM)诱导下,Hela细胞呈现衰老表型,细胞变大变扁平,胞浆空泡增多,SA-βGal染色呈阳性着色,细胞周期阻滞在G2/M期,细胞调亡不明显,P53、P21、P-CDC2基因在顺铂诱导衰老过程中表达增强。分别转染50nM siRNA-vimentin和50nM siRNA-HPV 18 E6后,增敏顺铂(1.650μM)诱导Hela细胞衰老(P<0.05);共转染50nM siRNA-vimentin和50nM siRNA-HPV18 E6后,Hela细胞衰老率增加,且增敏顺铂(0.825μM)诱导Hela细胞衰老(P<0.05)。衰老细胞变大、变园、扁平,衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性;细胞周期G2/M期阻滞;vimentin、P53、CDC-2表达上调,HPV 18 E6表达下调。结论:七种与HPV18E6相互作用的蛋白质可能是潜在的宫颈癌检测指标。TMEM87B是一种6次跨膜的分泌性蛋白,可能与肿瘤生成信号转导和转录调控相关;HPV18 E6和vimentin直接相互作用可能抵抗了顺铂诱导宫颈癌细胞衰老。