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细胞色素P450氧化酶(CYPs)是自然界中最普遍的生物催化剂,可以催化成千上万种反应。昆虫CYPs对于昆虫适应不同的环境有着重要的作用,一方面,CYPs可以氧化多种外源化学物质如杀虫剂、植物次生物质、环境化合物、诱变剂前体等;另一方面,CYPs也参与合成和降解多种内源性物质如甾醇、脂肪酸、信息素、保幼激素和蜕皮激素,在昆虫的整个发育过程中有着非常重要的生理功能。因此,CYPs具有重要的研究价值和潜在的经济价值。本文基于马铃薯甲虫转录组数据和GenBank序列,利用RT-PCR相RACE技术获得了蜕皮激素合成相关基因CYP314A1、新基因CYP412A1、CYP412A2和CYP413A1的全长cDNA序列,并采用RNA干扰和真核表达的方法研究了4个CYPs基因的功能,现将研究结果总结如下：1、马铃薯甲虫4个细胞色素P450氧化酶基因的克隆基于马铃薯甲虫转录组数据和GenBank序列,共鉴定出74个细胞色素P450氧化酶基因。这些基因属于19个家族35个亚家族。利用RT-PCR和RACE技术获得了蜕皮激素合成酶相关基因CYP314A1、新基因CYP412A1、CYP412A2和CYP413A1的全长cDNA序列。分析了这4个基因在不同发育阶段、不同组织中的表达谱。发现这4个基因在马铃薯甲虫的所有发育期和所有组织中均表达,且具有各自特有的时空表达谱。表明这4个基因具有非常重要且各不相同的生理功能,值得进一步研究。2、马铃薯甲虫中4个细胞色素P450氧化酶基因的RNA干扰效应测定了喂食大肠杆菌表达的dsLdCYP314A1、dsLdCYP412A1、dsLdCYP412A2、和dsLdCYP413A1对马铃薯甲虫2龄和4龄幼虫的影响。结果表明,2龄幼虫取食含有上述dsRNA浸渍的叶片后,靶基因mRNA水平显著下降,死亡率明显提高,体重大幅下降,发育历期延长,化蛹率降低,部分幼虫表型异常。4龄幼虫取食后,靶基因mRNA水平显著下降,化蛹率降低。dsLdCYP314A1和蜕皮激素或其类似物氯虫酰肼同时饲喂时,部分或完全补偿了dsLdCYP314A1单独饲喂所产生的不利影响,从而证实了LdCYP314A1的编码产物参与蜕皮激素的合成。3、马铃薯甲虫4个细胞色素P450氧化酶的真核细胞表达与功能验证为明确马铃薯甲虫4个细胞色素P450氧化酶的相关功能,利用昆虫杆状病毒表达系统,分别构建了4个CYPs基因pFastBac1的重组供体质粒pFstBac1-CYP314A1、pFastBacl-CYP412A1、pFastBac1-CYP412A2和pFastBacl-CYP413A1,并利用昆虫细胞系Sf9在体外表达CYPs。蛋白杂交结果显示,Sf9细胞感染重组供体质粒后的细胞裂解液在55 kDa左右均出现了目标条带；同时,感染空载和GFP的细胞裂解液未出现特异性条带,表明4个CYPs基因均成功表达。测定了表达CYP314A1的粗酶液酶活,发现CYP314A1与底物E反应2 h后生成的产物经RP-HPLC分离显示具有两个高峰,并且时间与20-羟基蜕皮酮(20E)和蜕皮激素(E)的标准品一样,分别为12 min和15 min；而相同条件下GFP与底物E反应生成的产物经检测仅有一个高峰,洗脱时间与E相同,为15 min。表明CYP314A1在体外成功将底物E催化生成产物20E。