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肾细胞癌是发病率仅次于膀胱癌的泌尿系统肿瘤。肾透明细胞癌是肾细胞癌中最为常见的组织学类型,也是导致肾癌患者死亡的主要病理类型。因此研究肾透明细胞癌的发生、发展有重要的意义。肾透明细胞癌对于化疗、放疗均不敏感,早期肾透明细胞癌的首选治疗方法为手术治疗,晚期肾透明细胞癌依赖于靶向治疗,但治疗效果欠佳。如何提高肾癌的早期诊断率,延缓或阻断肾癌的远处转移,延长晚期肾癌患者的生存时间成为肾癌领域研究的主要目的。高通量组学技术的发展,为探寻肿瘤的早期诊断标记物和精准治疗靶点提供了有力的研究手段。Annexin A4是Annexins蛋白家族成员,可以调节细胞膜通透性和膜转运,诱导钙离子信号转导,在细胞外吞和膜修复中发挥作用,参与细胞生长和凋亡。既往研究发现Annexin A4在多种上皮肿瘤中表达异常,与肿瘤的进展、侵袭、迁移、粘附和耐药性相关。为探究肾透明细胞癌的蛋白质组学特点,分析其发生发展过程中关键的生物学标志物,探究ANXA4在肾透明细胞癌中所发挥的作用,进行了以下四部分研究。第一部分:肾透明细胞癌与癌旁组织的差异蛋白质组学研究为建立肾透明细胞癌差异蛋白表达谱,探寻肾透明细胞癌可能的生物标志物,采用TMT标记的二维液相色谱-质谱联用技术对12对肾透明细胞癌组织及癌旁组织进行蛋白质组检测。通过Metascape数据库对差异蛋白进行GO分析及KEGG分析。结果发现,与癌旁组织相比,在肾透明细胞癌组织中显著高表达的蛋白为:CA9、NNMT、NDUFA4L2、PLIN2、SCGN、SLC16A3、TYMP、TGM2、ANXA4、AHNAK2、PFKP等。在肾透明细胞癌组织中显著低表达的为:MT2A、GATM、ACSF2、CPQ、SMIM24、PLA2G4F、ACY1、NDUFA4、GPX3、UMOD、TACSTD2、SLC13A3等。GO分析和KEGG分析发现,差异蛋白主要参与到与细胞代谢、增殖、侵袭、凋亡相关的功能、通路。结果表明,利用TMT标记的定量蛋白质组学技术可以建立肾透明细胞癌及癌旁组织中差异蛋白表达谱。ANXA4等可能作为肾透明细胞癌生物标记物的候选蛋白。第二部分:Annexin A4多克隆抗体的制备及其在肾透明细胞癌中的差异表达验证为验证第一部分研究中关于ANXA4差异表达的结果,我们按下述方法制备了ANXA4多克隆抗体:通过优化条件,设计并合成Annexin A4多肽片段,以此为抗原免疫新西兰兔,收集含有多克隆抗体的血清,经过抗体纯化后,获得高效价及高特异性的ANXA4多克隆抗体。应用该抗体,通过免疫印迹及免疫组化方法验证肾透明细胞癌及癌旁组织中Annexin A4蛋白的表达量及表达位置,并分析Annexin A4表达水平与肾透明细胞癌临床病理参数之间的关系。结果发现,ANXA4在肾透明细胞癌组织中的表达量高于癌旁组织,其表达量与肿瘤TNM分期、淋巴结转移情况相关（p<0.01）。ANXA4在肾透明细胞癌组织中趋向胞膜表达,在癌旁组织中趋向胞浆表达。结果表明,ANXA4在肾透明细胞癌中高表达,且表达量与肾透明细胞癌的TNM分期、淋巴结转移相关。ANXA4在肾透明细胞癌中存在异位表达。第三部分:ANXA4对肾透明细胞癌细胞生物学行为的影响为了进一步明确ANXA4对肾透明细胞癌生物学行为的影响,应用过表达质粒转染技术及sh RNA慢病毒侵染技术分别构建ANXA4稳定过表达及沉默表达的肾透明细胞癌786-O细胞系。通过细胞划痕实验、Transwell实验、流式细胞术检测细胞凋亡、Hoechst33258染色检测细胞凋亡、CCK8增殖实验、克隆形成实验从体外水平观察ANXA4对肾透明细胞癌细胞迁移、侵袭、凋亡、增殖等生物学行为的影响。通过肿瘤细胞裸鼠皮下荷瘤、腹腔注射等方法,从体内水平加以验证。结果发现,ANXA4过表达后,肾透明细胞癌786-O细胞迁移、侵袭能力明显增加,抗凋亡能力增强,增殖能力无明显变化。ANXA4沉默表达后,786-O细胞迁移、侵袭能力明显下降,抗凋亡能力减弱,增殖能力无明显变化。裸鼠皮下成瘤实验证实ANXA4对786-O细胞体内增殖能力无明显影响,肿瘤细胞裸鼠腹腔注射证实ANXA4过表达可增强786-O细胞体内侵袭能力。结果表明,ANXA4可促进肾透明细胞癌细胞迁移、侵袭,增强其抗凋亡能力。第四部分:ANXA4影响肾透明细胞癌生物学行为的机制研究为进一步探究ANXA4影响肾透明细胞癌生物学行为的机制,我们选择与细胞侵袭、迁移、凋亡密切相关的关键分子:E-cadherin、Snail、MMP9、Bcl2,及可能调控它们的通路蛋白:ERK1/2、p ERK1/2、β-catenin、pβ-catenin,应用western blot技术检测ANXA4过表达及沉默786-O细胞中上述蛋白的含量。结果发现,与对照组相较,ANXA4过表达后,786-O细胞中E-cadherin表达减少（p<0.01）,其抑制因子Snail表达增多（p<0.0001）,MMP9表达增多（p<0.01）;p ERK1/2表达增多,p ERK1/2与ERK1/2比值增大（p<0.001）;β-catenin表达量高于对照细胞,β-catenin与pβ-catenin比值增大（p<0.05）;Bcl2表达增多（p<0.001）。ANXA4沉默表达后结果相反。结果表明,ANXA4可能通过ERK/MAPK/E-cadherin/β-catenin通路调控肾透明细胞癌细胞的迁移、侵袭及凋亡。通过以上研究,我们得出以下结论:1.利用TMT标记的定量蛋白质组学技术可建立肾透明细胞癌及癌旁组织中差异蛋白表达谱。ANXA4、CA9、NNMT、NDUFA4L2、PLIN2、SCGN、SLC16A3、TYMP、TGM2、AHNAK2、PFKP等可能作为肾透明细胞癌生物标记物的候选蛋白。2.ANXA4在肾透明细胞癌中高表达,且表达量与肾透明细胞癌的TNM分期、淋巴结转移相关。ANXA4在肾透明细胞癌中存在细胞内异位表达。3.ANXA4可促进肾透明细胞癌细胞迁移、侵袭,增强其抗凋亡能力。4.ANXA4可能通过ERK/MAPK/E-cadherin/β-catenin通路调控肾透明细胞癌细胞的迁移、侵袭及凋亡。